高分综述丨CHEM REV(IF:62): 微生物组与人类健康: 当前的理解、工程和支持技术(下)

编译：微科盟蔚蓝，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

人体微生物组由栖息在人体不同解剖位置的动态微生物群落组成。微生物组与宿主的共同进化导致这些群落在促进人类健康方面发挥着深远的作用。因此，人体微生物组的紊乱会导致或加剧多种疾病。本篇综述介绍了目前对人类健康与疾病发展之间关系的理解，重点关注消化、呼吸、泌尿、生殖系统以及皮肤中发现的微生物组。本文还进一步讨论了可以调节人体微生物组的组成和功能进而对宿主发挥治疗作用的多种策略。最后，还研究了多组学方法和微生物细胞重编程等技术，这些技术可以使微生物组研究和工程取得重大进展。  

图文摘要      

论文ID

原名：Microbiome and Human Health: Current Understanding, Engineering, and Enabling Technologies

译名：微生物组与人类健康：当前的理解、工程和支持技术

期刊：Chemical Reviews

IF：62.1

发表时间：2022.11

通讯作者：Matthew Wook Chang

通讯作者单位：新加坡国立大学

DOI号：10.1021/acs.chemrev.2c00431

综述目录

1 前言

2 人体微生物组

2.1 影响人体微生物组的因素

2.2 人体不同部位的微生物群及其与健康/疾病的关系

3 设计用于治疗应用的微生物组的策略

3.1 改变微生物组的种群动态

3.2 改变微生物组的功能

3.3 天然和合成的微生物菌群

3.4 微生物组工程当前面临的挑战和局限性

4 微生物组研究和工程的支持技术

4.1 功能组学方法

4.2 合成生物学和微生物的细胞重编程

4.3 底盘工程

5 挑战和限制

主要内容

3.3 天然和合成的微生物菌群

微生物群落，如人类微生物群落，执行由群落内部和与环境的动态相互作用形成的复杂功能。这种复杂的功能不太可能由单一种群实现，这引起了对微生物群落的高度兴趣。此外，群落内微生物多样性的增加也可能赋予其应对环境变化的能力，例如营养限制。目前，两种类型的微生物群落被应用于治疗：一种是天然存在的菌群，成分不确定，如肠道微生物群，可用作粪便微生物群移植(FMT)；合成菌群，包括预先确定的益生菌或共生微生物的混合物。在此，我们将讨论将这些微生物菌群用于治疗各种疾病的一些例子以及这些方法面临的挑战。

3.3.1 粪便微生物群移植

FMT包括给药干燥的粪便，来自患者自身或健康供体(图4)。给药途径可能有所不同，包括口服冻干胶囊、经小肠/大肠输注以及灌肠。其目的是将原生疾病相关的微生物组重建使其更健康，以提供积极的健康影响。FMT在复发性艰难梭菌感染中显示出巨大潜力，其治愈率为85-90%，被强烈推荐用于轻度、重度病例。在一项随机临床试验中，经初始万古霉素治疗后，艰难梭菌感染患者的FMT疗效高于持续使用万古霉素的治疗疗效，同时伴有拟杆菌门和梭菌的增加以及变形菌门的减少。在给予广谱抗生素的小鼠和人类中，自体FMT能够在几天内快速完全恢复失调的微生物组，是最有效的干预措施。令人惊讶的是，与自然恢复相比，益生菌混合物的给药显著延迟了微生物组的恢复且其恢复并不完全。这归因于益生菌产生的可溶性因子对原生微生物组的抑制作用。除艰难梭菌感染外，FMT还被用于治疗溃疡性结肠炎、2型糖尿病、肠易激综合征和癌症；然而，迄今为止只报告了有限的案例研究和临床试验。需要进一步精心设计的临床试验来证实FMT对艰难梭菌感染以外适应症的疗效。 在FMT广泛应用于临床实践之前，有部分方面必须考虑和研究。选择合适的供体是FMT成功的关键因素之一。尽管自体FMT相容性较好，但可能并不总是可行，因此需要粪便供体。FMT前需要仔细筛查供体肠道微生物组的潜在致病物种以确保操作的安全性。因为在单个粪便样本中检测到SARS-CoV-2病毒，这在COVID-19大流行时期尤其重要。此外，已经进行了研究以确定粪便样本最有可能成功植入肠道微生物组的供体。高分类多样性和供体粪便中特定细菌科的存在被认为是受体肠道稳态的疾病特异性恢复的关键。除了供体选择之外，受体的遗传、饮食和生活方式也可能在FMT维持中发挥作用。

Seres Therapeutics开发了SER-109作为FMT的替代方案，这是一种来自健康供体细菌孢子的天然联合体，用于治疗复发性艰难梭菌感染。这种孢子主要来自厚壁菌门细菌，因为其他细菌门不产生孢子。这是有利的，因为既往研究表明厚壁菌门与相对较高浓度的次级胆汁酸有关，后者可抑制艰难梭菌的营养生长。此外，这些胆汁酸还可以防止艰难梭菌孢子萌发(复发性感染的主要原因)。由于孢子对胃酸具有抗性，因此纯化孢子联合体可以口服给药，从而降低FMT中病原体传播的风险。在一项包含182名患者的随机、双盲、安慰剂对照3期临床试验中，与抗生素治疗后接受安慰剂的患者相比，标准抗生素治疗后口服SER-109的患者组艰难梭菌感染的复发率降低(12% vs 40%)。接受SER-109的患者在1周内植入了给药菌种，并在研究期间持续存在(8周)，厚壁菌门的丰度增加，促炎肠杆菌科减少。给予SER-109的患者粪便样本中也观察到了较高浓度的次级胆汁酸。

图4. 通过粪便微生物群移植(FMT)和合成菌群来改造微生物组。

3.3.2合成微生物菌群

由于天然存在的微生物群落结构尚不明确，难以量化单个成员对特定功能的贡献，所以并不适合进一步优化。合成菌群可以满足这种未实现的需求，因为它可经合理设计并降低微生物复杂性以执行可预测地为宿主带来治疗益处的功能。例如，Tanoue等人从健康人类供体的粪便中分离出一个由11种菌株组成的菌群，可以稳定地诱导肠道中产生干扰素γ的CD8+ T细胞。这11株菌株是低丰度微生物组成员，包括Bacteroides、Parabacteroides的某些物种以及Eubacterium limosum、Ruminococcaceae bacterium cv2、Phascolarctobacterium faecium和Fusobacterium ulcerans。在小鼠体内定植后，微生物群提供了对Listeria monocytogenes感染的抵抗力，并增强了肿瘤模型中免疫检查点抑制剂的疗效。 GUT-108是一个由11种菌株组成的设计合理的菌群，在小鼠模型中也被证明可以逆转结肠炎。该菌群包括可执行IBD患者肠道微生物组中减少的功能的菌株。这些功能包括生产SCFA(如丁酸盐和丙酸盐)、次级胆汁酸、脱氧胆酸、石胆酸、吲哚及其衍生物。 此外，GUT-108中的一些菌株产生抗菌因子，阻止可能会进一步加剧炎症反应的条件致病菌的生长。在接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)的小鼠中观察到，实验性结肠炎小鼠模型给予GUT-108可阻止肠杆菌科致病菌的扩增。在小鼠中观察到GUT-108的10种菌株的成功植入导致炎症细胞因子减少、诱导IL-10的产生，并增加促进粘膜愈合和免疫调节反应的代谢物水平。 除了由野生型菌株组成的合成菌群外，具有明确特征的工程细菌也可用于开发合成菌群。例如，Kong等人创造了6个具有从共生到捕食的独特相互作用的双菌株群落。他们利用这些菌株进一步开发了具有可预测行为的三株和四株成员群落，证明了细菌群落中相互作用的成功工程。这种方法可以设计出具有更复杂行为的合成菌群从而使宿主获益。 与单一微生物种群相比，微生物菌群的设计面临着独特的挑战。与天然微生物组类似，合成群落应能够维持体内平衡并防止某些成员在不同的营养环境中超过其他成员。但这很难实现，因为微生物通常表现出不同的代谢各种资源的能力，这使得长期预测体内稳态不可行。应用合成生物学将遗传回路纳入微生物中可能会缓解菌群成员之间的竞争。另一个挑战是预测微生物群落的行为，这可以归因于缺乏对微生物之间代谢相互作用的组学水平的理解。通过多组学研究与计算机建模相结合获得的知识最终将提升设计具有可预测和可控功能的合成菌群的能力。

3.4微生物组工程当前面临的挑战和局限性

前面给出的示例(总结在表2中)表明，在宿主体内设计微生物组以实现各种治疗结果是可行的。迄今为止，对调节微生物组组成和功能的不同方法的体外和体内评估已经显示出有希望的结果。除FMT外，大多数治疗方法仍在等待成功的临床转化。前文已经提到过开发基于合理设计微生物组的不同治疗方法存在独特的挑战。然而，为了进一步加速微生物组工程以开发安全有效的治疗产物，需要弥补微生物-微生物和微生物-宿主相互作用相关知识的差距，并构建新的工具来扩大微生物组工程的范围，如下文所述。

表2. 设计针对不同疾病的微生物组的方法总结。

3.4.1多组学研究应用不充分

作为人类微生物组计划(HMP)的一部分，使用16S rRNA基因测序对人体中的不同微生物群落进行全面表征以破译微生物组的分类复杂性。同时，宏基因组全基因组鸟枪法测序提供了对微生物组及其功能的深入了解。然而，这些数据集并未阐明微生物群落内的相互作用、微生物组如何与宿主相互作用以及宿主对其常驻微生物组的反应。深入了解这些相互作用对于确定微生物组在疾病发展中所起的因果作用是必要的，最终将利用微生物组工程产生新的疗法。为实现这一目标，健康和患病队列必须接受各种多组学分析(包括微生物组和宿主)。HMP第二阶段正进行早产、IBD和2型糖尿病的研究。对于IBD，收集IBD患者和健康对照者的粪便样本用于多组学分析，如16S rRNA基因测序、宏基因组和宏转录组测序、蛋白质组学和代谢组学。此外，对结肠活检样本进行RNA-seq以研究宿主基因组的DNA甲基化，并探索具有不同代谢物的宿主细胞来确定宿主的相应变化。重要的是，该研究还将纳入微生物组中发现的酵母菌和病毒的调查。

3.4.2工程微生物组的时空控制

为了使工程微生物组安全地给宿主提供健康益处，它应该有可预测的时空行为。环境扰动和空间组织是影响微生物组复杂和动态相互作用的主要变量。例如，Sheth等人研究了小鼠肠道微生物的生物地理学，并显示了个体分类群之间的正、负关联。此外，作者表明低脂肪或高脂肪饮食小鼠出现物种丰富度的改变以及结肠微生物组空间组织的改变。因此，工程微生物组应能适应任何扰动，并能够在不同的时间尺度上适应其群落结构，以继续为宿主提供预期的治疗效果。这对于有相关适应成本的工程微生物组尤其重要，这可能通过随机突变和水平基因转移导致进化适应。在共生微生物脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)中也观察到了类似的适应，并导致其在人体肠道中长期流行。此外，保护宿主免受意外微生物群功能影响的机制应该作为一种安全功能内置。 合成生物学是实现这种水平的微生物组组成和功能动态控制的潜在方法。可以将遗传功能(如生物传感器)整合到微生物组中，这样就可以通过外部刺激来控制。此外，可以设计遗传回路进行微生物组的自主反馈控制。

3.4.3遗传难治性微生物

大多数与人类健康最相关的微生物组成员仍然难以培养，且难以在遗传上处理，如Clostridium和其他厌氧厚壁菌门细菌。这阻碍了我们研究这些微生物调控人类健康的机制。阐明这些机制不仅将加深我们对宿主-微生物组和微生物组内相互作用的理解，而且还有助于更有效的基于微生物组的疗法，包括促进健康的细菌。因此，急需开发可用于这些遗传难治性微生物的新型基因工程工具。这些工具范围从特征明确的启动子、核糖体结合位点、终止子和报告基因到更复杂的基因组操作系统，如 CRISPR-Cas和同源重组。 在下一节中，我们将讨论如何借助支持技术克服这些挑战，促进我们对微生物组-宿主相互作用的理解以及基于微生物组的有效疗法的开发。

4微生物组研究和工程的支持技术

包括第3节中提及的例子在内的许多研究都支持工程微生物治疗微生物组相关疾病的可行性。虽然已进行了许多概念验证研究，但一些使用工程微生物的临床试验未显示出疗效或由于疗效缺乏而在2期试验中终止(如NCT03447730、NCT03234465和NCT03447730)。这些工程微生物疗效缺乏的一个促成因素可能是缺乏调控机制。通常这些机制控制微生物组中稳定启动子下外源基因的表达，以增强疗效或减少副作用。与传统化学药物相比，利用微生物作为治疗剂的优点之一是其具有很高的可编程性。合成生物学方法有望提高效率并减少副作用，利用对工程微生物实施精确的空间/时间控制所赋予的高可编程性。 为了充分利用工程益生菌进行治疗，必须牢记基于对微生物组相关疾病和微生物组本身的机制见解的更复杂知识的工程方法和设计。如第3.1.1所述，在不改变肠道微生物组组成的情况下，对超重/肥胖个体施用巴氏杀菌的A. muciniphila可改善胰岛素敏感性，降低胆固醇和体重。除了强调监测微生物组活性的重要性外，这一结果表明微生物组的功能或活性变化可能比微生物组组成更为重要。因此，代谢组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和多元组学等功能元组学在分子、基因和通路水平上研究微生物组相关疾病的因果关系正受到关注。 本节将回顾各种元组学方法以了解微生物群落和宿主相互作用中的分子见解。还将介绍许多可以促进微生物重编程的合成生物学工具，以开发与其他微生物组工程策略相比具有独特优势的强大疗法。

4.1功能组学方法

宏基因组学是研究微生物群动态的有力工具，揭示了微生物群组成与许多疾病之间的关联。然而宏基因组数据对微生物组相关的健康状态提供的机制见解有限。为了解决这一差距，将代谢组学、宏转录组学和宏蛋白质组学等功能元组学方法应用于微生物群有望提供进一步的见解。本节将回顾将功能组学应用于微生物群以研究关键代谢物、微生物组活性和宿主/疾病的相互作用的最新进展。此外，还回顾了微生物组和宿主遗传学的相互作用。

4.1.1新型代谢物的发现和生物合成

微生物群衍生的代谢物在宿主-微生物相互作用中起着比共生微生物本身更关键的作用。然而，宿主-微生物相互作用背后的代谢物和生物合成途径尚不清楚。一些研究表明，微生物通过代谢物调节信号通路与宿主相互作用。例如乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐等SCFAs在结肠中由膳食纤维发酵而来。已知SCFAs通过激活G蛋白偶联受体调控调节性T细胞(Treg细胞)的分化和聚集，被激活的Treg细胞产生可以抑制IBD等肠道炎症疾病的抗炎因子IL-10。由于代谢途径的功能冗余，微生物组组成与代谢物之间的联系是间接的，这表明某些物种具有互换性。因此，分析微生物组成的差异可能无法反映功能代谢物的差异。事实上，从代谢组学数据进行系统发育预测未成功，这表明将微生物组和代谢组学数据联系起来存在困难。因此，识别与疾病相关的代谢物可以为实施用于治疗目的的合成方法提供更直接的数据。 利用质谱的非靶向代谢组学已被用于发现与疾病相关的关键代谢物。Koh等人进行了2型糖尿病的非靶向代谢组分析，发现咪唑丙酸在2型糖尿病患者中浓度较高。肠道微生物从组氨酸中产生咪唑丙酸，并通过mTORC1损害胰岛素信号传导。此前，研究人员确定了体外产生咪唑丙酸的UrdA基因，发现UrdA基因在2型糖尿病患者中更为丰富。另一个例子是苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)，非靶向代谢组分析将其鉴定为2型糖尿病患者患心血管疾病风险较高相关的生物标志物。在肠道中，PAGln通过微生物porA基因由膳食苯丙氨酸转化而来，研究表明它通过刺激G蛋白偶联受体来增强血小板活化相关表型。 非靶向质谱法是将目标化学物质的光谱模式与参考数据库中的化学物质进行比较来识别分子，因此代谢物鉴定完全依赖于分析中使用的参考物。这意味着非靶向鉴定无法识别未知化学物质。事实上，据估计，微生物组中>90%的代谢物在公共数据库中均不能匹配。这种未表征的代谢物被称为“暗物质”。为了解决这一问题，基于机器学习的数据库生成日益重要。机器学习是一种自动构建用于分类或预测的数学模型的方法，机器学习中算法从训练数据集中学习模式。机器学习已被广泛用于各种应用程序，证明了其多功能性。目前，机器学习被用于数据预处理(峰值检测、比对和鉴定)、数据处理(结构鉴定和化合物定量)和生物学解释过程中识别微生物组代谢物。例如，DarkChem使用深度学习方法生成MS/MS文库，用于预测代谢组学和化学鉴定中的化学性质。

4.1.2宏转录组学和宏蛋白质组学

宏转录组学中使用RNA测序分析微生物群的转录活性。与宏基因组学不同，宏转录组学允许鉴定微生物群落中的活性微生物、基因和通路。此后，宏转录组学已被应用于许多不同类型的微生物群，包括来自海水、土壤和人类的微生物群。同样，人类微生物群的宏转录组学方法也使人们能够更深入地了解宿主-微生物群相互作用、活性微生物及其通路以及疾病进展中的表达变化。Nowicki等人展示了如何将宏转录组学应用于牙龈炎患者的龈下菌斑，该研究发现随着牙龈炎的进展，微生物群组成发生了显著变化，毒力基因表达增加，证明转录组学分析对于了解疾病进展过程中的分子机制的重要性。而Schirmer等人对IBD纵向队列进行了宏转录组学分析，以阐明健康个体和IBD患者之间的基因表达及其差异。在这项研究中，他们发现了转录活性中的物种特异性偏差。一个例子是甲基赤藓糖醇磷酸途径(MEP)基因，他们证明在重度IBD中Bacteroides vulgatus是MEP的主要转录贡献者。这项研究强调了宏转录组学分析是监测微生物组活动并进一步了解微生物组在疾病中的作用的有力工具。 虽然RNA表达可以很好地反映基因表达，但它并不总是反映蛋白质的丰度。宏蛋白质组学可以作为监测微生物群中基因活性的一种替代方法。在2009年的一项研究中，宏蛋白质组学最初被应用于研究环境中以及双胞胎肠道微生物组样本的微生物功能。到目前为止，多项研究已经证明了如何将宏蛋白质组学分析用于人类微生物组样本。虽然宏蛋白质组学不如宏转录组学那样普遍，因为与基于深度测序的分析相比，宏蛋白质组学的通量较低，但宏蛋白质组学可以提供有关蛋白质翻译后修饰以及宿主细胞分泌的蛋白质表达的信息，而这两者都不能通过宏转录组学进行监测。 Zhang等人的另一项研究分析了克罗恩病患者和阴性对照受试者肠道微生物组中蛋白质的赖氨酸乙酰化(Kac)变化。这项研究采用了肽免疫亲和富集策略，然后用质谱法来表征Kac肽及其在人类肠道微生物组中的变化。使用该方法，他们鉴定了52种宿主蛋白Kac位点和136种微生物蛋白Kac位点，这些蛋白在克罗恩病患者和非患者之间发生了不同的修饰。同样，Lobel等人研究了饮食对慢性肾脏疾病(CKD)模型小鼠肠道微生物组中蛋白质翻译后修饰的影响，发现含有高硫氨基酸的饮食会诱导微生物色氨酸酶的翻译后修饰。蛋白质修饰减少了CKD模型小鼠中尿毒症毒素的产生。这些研究表明，翻译后修饰可以改变微生物组功能，而不会改变其组成，这表明了宏蛋白质组学在研究微生物组相关表型的机制见解方面的重要性。 鉴于元组学方法相关的优缺点，多元组学方法已被用于全面了解微生物群基因活性以及微生物群内或微生物群与宿主之间的相互作用。一个人类微生物组研究团队对IBD纵向队列进行了多组学分析，以阐明宿主的分子谱和微生物组活性。该研究对来自132名受试者的1年的粪便和血清样本进行了宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学分析。这项研究提供了宿主和微生物活性的全面描述，有助于识别导致失调的微生物、生化和宿主因素。Mills等人联合宏基因组学、宏蛋白质组学和代谢组学方法研究250份溃疡性结肠炎(UC)患者的粪便样本，发现来自B. vulgatus的蛋白酶活性与UC严重程度有关。体外和体内实验还表明，用蛋白酶抑制剂治疗可以缓解UC症状，突出了多组学方法在从复杂的微生物组中鉴定致病基因方面的潜力。

4.1.3微生物组全基因组关联研究

传统上认为微生物组组成的个体间变异主要受环境因素(而不是宿主遗传因素)的影响。然而双胞胎和家族的研究表明微生物组与宿主遗传之间存在相互作用。在一项英国双胞胎研究中，同卵双胞胎中肠道微生物群的相对丰度比异卵双胞胎更密切相关，这表明微生物组和宿主遗传学之间的相互作用影响了肠道微生物群组成。深入了解宿主遗传学和微生物组相互作用可辅助精准医学疗法并提高工程微生物疗法的疗效。 与微生物组变异相关的大部分已鉴定遗传位点与宿主的饮食偏好或其免疫力有关。LCT位点是复制最多的基因组位点之一。对英国、荷兰、加拿大和芬兰人群的研究表明，LCT位点与Actinobacteria或Bifidobacterium之间存在关联。LCT编码在肠道中消化乳酸的乳糖酶。LCT位点与Bifidobacterium最密切相关的是功能SNP rs4988235。已知该SNP与乳糖不耐受和乳糖酶表达密切相关。因此，乳糖不耐受是乳糖酶表达过低而导致乳糖无法消化。Bifidobacterium具有消化乳糖的能力，表明它们代偿了宿主中降低的乳糖酶活性。微生物组组成中另一个复制良好的位点是ABO。德国、芬兰和荷兰人群中进行的研究中报告了微生物组与ABO位点的关联。但与ABO位点相关的细菌在三个国家之间有所不同。除ABO位点外，FUT2也与微生物组有关，FUT2基因决定了粘膜细胞上的ABO抗原。ABO和FUT2之间的功能关联表明ABO位点是微生物组组成的一个促成因素。然而微生物组改变背后的机制尚未阐明。尽管许多基因组位点与微生物群组成有关，但在其他研究中大多数基因位点并未被复制。 最后，宿主遗传变异会影响宿主的健康状态。一个众所周知的例子是ATG16L1位点。ATG16L1编码自噬相关ATG12-ATG5/ATG16L1复合物的一个亚基，并参与自噬体的形成。但它的功能并不局限于自噬，它还参与炎症等免疫反应。一些全基因组关联研究(GWASs)显示了IBD与ATG16L1位点间的关联。Chu等人揭示了ATG16L1对B. fragilis的免疫调节至关重要，已知B. fragilis分泌外膜囊泡(OMV)，包括诱导调节性T细胞的免疫调节分子。该研究表明，ATG16L1(A300)的风险等位基因没有表现出OMV介导的调节性T细胞诱导粘膜炎症抑制的作用，也表现出ATG16L1的缺陷。这些结果表明宿主变异-微生物群的相互作用以及考虑宿主遗传因素对于治疗的重要性。

4.2微生物的合成生物学和细胞重编程

合成生物学旨在设计和制造具有可预测和一致所需功能的生物体。为了实现这一目标，合成生物学引入了生物工程原理，如模块化、逻辑门和电路设计。这些工作使研究人员能够选择最佳遗传部分(例如启动子、核糖体结合位点、终止子、肽标签和生物传感器)，构建所有类型的逻辑门(AND、OR、NOR、NOT、XOR和NAND)以及类似于振荡器等机器和基因拨动开关的可以控制微生物的合成设备。反过来，这些特性良好且可调的部件允许通过称为设计-构建-测试-学习循环(DBTL循环)的优化周期组装功能更强大的系统。本小节将回顾如何将合成生物学用于细胞重编程。我们还将讨论合成生物学如何允许工程微生物的时空调控，以及如何将这些技术应用于微生物组环境。

4.2.1使用遗传逻辑电路调节微生物行为

逻辑门是一种通过将二进制输入处理为二进制输出来执行基本逻辑功能的电子装置。大多数逻辑门按照真值表将两个输入处理成一个输出(图5A)。例如，仅当两个输入均为1时，AND门输出为1，当任一输入为1时，OR门输出为1。每个逻辑门都可以操作一个简单的任务。但具有多个逻辑门的装置可以像计算机一样处理复杂的任务。合成生物学主要通过转录因子连接的转录网络实现遗传逻辑门的开发和实施。在合成逻辑门中，表达式表示1，没有表达式表示0。AND门可以通过使用需要两个转录激活因子的启动子来构建(图5B)。AND门可以成为调控输入和输出的非常强大而有用的工具。例如，Merk等人构建了一个遗传AND门，当ITPG和连四硫酸盐同时存在时，该门表达输出基因。由于IPTG是一种人工诱导剂，而连四硫酸盐是肠道炎症标志物，因此AND门允许特定基因表达的时间和空间调控。虽然在研究者的概念验证研究中被GFP用于输出，但AND门可以通过相应地改变输出在时间或空间上控制药物的原位分泌。 此外，这种逻辑门是可扩展的，可以通过连接多个可处理更复杂环境的逻辑门来适应输出和输入数量的增加。Taketani等人通过组合三个NOR门开发了一个2输入和3输出逻辑电路。然后在Bacteroides thetaiotaomicron中实施该电路，使细菌能以环境依赖性方式表达不同的基因，例如生物反应器阶段，肠道阶段以及从宿主中释放后。在这项研究中，他们使用无水四环素(aTc)和脱氧胆酸(DCA)作为输入，并展示了在人类胃肠道模型中工程化的B. thetaiotaomicron如何以依赖输入的方式改变其行为。这些概念验证研究表明，可扩展的逻辑门允许在复杂环境下对工程微生物进行空间和时间调控。因此，以环境依赖性方式表现的独立工程微生物的使用可提高其活性的特异性和定位，从而提高整体功效。 振荡器是一种输出周期性信号的电子设备。Elowitz和Leibler构建了一个周期性表达标记基因的遗传振荡器。在原始遗传振荡器中，三个转录抑制因子LacI、TetR和cI编码在一个称为压缩振荡子的质粒中，GFP编码在另一个质粒中的pLtetO1。因为TetR抑制cI，cI抑制LacI，而LacI抑制TetR表达，所以每个基因的表达周期性变化。GFP报告基因受TetR调控，其表达也呈周期性变化。尽管最初的压缩振荡子显示出周期性的GFP表达，但只有40%细胞的表达正常。该实验设计不够稳健，导致误差通过随机效应传播。Potvin-Trottier等人进行的后续研究通过去除附着在阻遏物上的降解标签并引入吸收TetR分子的“海绵”序列来改进原始研究。这些变化降低了随机效应，提高了遗传振荡器的稳健性。最近，Riglar等人在小鼠肠道环境中测试了振荡器的更新版本，以量化体内细菌动力学。他们开发了RINGS方法来估计同步后的细菌世代。振荡系统用于监测体内细菌动力学，但振荡系统也可用于原位药物的周期性给药。此外，这些研究强调了合成遗传回路如何通过DBTL循环在微生物组环境中正常运作。 前面介绍的遗传回路示例演示了如何使用不同的遗传部分(例如启动子，抑制因子和激活因子)重编程微生物以表现出所需的行为。在后续章节中，我们将回顾不同类型的细胞重编程，这些细胞重编程可以潜在地提高微生物疗法对微生物组相关疾病的疗效。  

图5. (A)逻辑门及其真值表。(B)转录AND门的一个例子。只有A和B都被诱导时，才会激活输出基因的表达。(C)合成逻辑门在工程微生物时空控制中的应用。(D)在压缩振荡子中发现转录网络。

4.2.2生物传感器和群体感应

为了处理环境信息，微生物可以配备生物传感器，可以检测pH、温度、光、金属以及化学和生物化合物等。在合成生物学中，生物传感器被集成到合成遗传回路中，以检测和处理下游加工的环境信息，这使得工程微生物能够以环境依赖的方式改变其行为，并在细菌群落之间进行交流。 为了设计治疗性微生物，将生物传感器植入到基因回路中可以提供几个优势。首先，基于生物传感器的表达可以减轻工程微生物的遗传负担并提高遗传稳定性。众所周知，应用合成遗传回路会对微生物造成负担，导致基因突变、工程功能丧失和工程微生物的生长缺陷。大多数遗传负担来自细胞资源的消耗、细胞适应性的降低。因此，通过生物传感器沉默遗传回路活性可以减轻遗传负担并保持工程微生物的功能。另一种减轻遗传负担的方法是通过群体感应(QS)使多个工程微生物协同工作。 其次，基于生物传感器的表达可以降低脱靶风险和由此产生的副作用。所有药物都有副作用，主要是因为其剂量或不必要的靶向。基于生物传感器的表达控制通常用于癌症治疗的发展，需要特定的靶向以减少严重的副作用。一种常见的策略是在来自可在肿瘤微环境中定植的细菌(例如Salmonella typhimurium、Clostridium novyi和EcN)缺氧启动子下表达抗癌产物。He等人设计了EcN，在氧依赖性Pvhb下表达Tum-5或p53，在肿瘤微环境等缺氧区域激活转录。He团队的研究将工程化的EcN注射到荷瘤小鼠中。他们证实，工程化的EcN可以抑制肿瘤生长，并且非特异性靶向不会产生明显的副作用。使用QS机器和抗菌剂使工程微生物感知并消除分泌QS信号分子的特定细菌。第三，生物传感器可以结合记忆系统用于诊断工具，这将在下一节中讨论。 生物传感器的特异性对于工程微生物的正常功能至关重要，特别是在复杂的异质环境中，例如包含几种结构相似配体的人体肠道。然而，野生型生物传感器通常是非特异性的，并且对几种结构相似的分子起反应。因此，需要开发能够在体内区分这些配体的生物传感器，以确保对疾病的精确反应。Meyer等人采用定向进化设计了12个具有较低交叉反应性的高特异性生物传感器。最近，Rottinghaus等人基于蛋白质结构，通过合理提高生物传感器特异性，设计了可用于芳香族氨基酸或神经化学物质特异性感应的EcN。这些研究扩大了用于治疗目的的高质量生物传感器的工具箱。

4.2.3记忆系统

细胞记忆是一种将瞬态信号转换为长时间响应的现象。细胞记忆在大多数生物体中很常见，并广泛用于生物事件，例如分化、表观遗传学和免疫。由于其潜在的应用，基于转录因子、DNA重组和RNAi等各种机制，研究者已构建了许多类型的合成记忆电路。 记忆系统可分为可逆或不可逆两类。可逆记忆系统可以在检测到另一个信号时关闭。Gardner等人构建了一个遗传开关，该开关可以通过实现LacI和cI或TetR相互抑制其表达，从而作为可逆记忆系统(图6A)。由于抑制因子相互抑制表达，共表达处于不稳定稳态，在没有任何刺激的情况下，在每个细胞中任一抑制因子的表达随机占主导地位。Gardner等人还证明，短暂暴露于抑制因子抑制剂可以改变细胞状态，并且在抑制剂停用后这种状态可持续很长时间。另一方面，一个不可逆记忆系统无法在检测到信号时关闭。O'Gorman等人利用Flippase开发了一种不可逆记忆系统，该系统在受到特定刺激后删除报告基因，并在哺乳动物细胞中保持报告基因的表达。

图6. (A) Gardner等人开发的遗传开关的基因回路。TetR和lacI各自抑制转录。在没有诱导剂时tetR或lacI表达占主导地位。每种诱导剂(aTc或IPTG)抑制抑制因子并诱导表达。细胞暴露于诱导剂时lacI或tetR占主导地位。(B)作为肠道炎症诊断工具的开关切换记忆电路。当ttrS/ttrR组分检测到炎症标志物连四硫酸盐时，Cro被激活。电路检测到连四硫酸盐时cro的表达占主导地位。

合成记忆电路是研究基本生物学机制的有用研究工具，并在医学和工业中具有潜在的应用前景。例如，用于创建组织特异性敲除菌株的Cre-loxP系统是一个不可逆的记忆系统，可用于研究特定器官和组织中的基因功能，因为它不会干扰其他器官和组织中的基因功能。该系统还被用于追踪细胞的发育谱系。对于工业应用，合成记忆电路可用于降低诱导剂的成本，以实现持续诱导以产生感兴趣的生化物质。通过结合生物传感器，合成记忆系统可以作为肠道微生物组相关疾病的非侵入性诊断工具。Kotula等人证明，使用cI/cro双稳态遗传开关的合成记忆电路可以在体内发挥作用。在Riglar等人的后续研究中，他们通过记忆系统和生物传感器来检测大肠杆菌菌株NGF-1中的炎症标志物连四硫酸盐，进而开发了一种肠道炎症诊断工具(图6B)。他们使用TtrR/TtrS双组分系统检测连四硫酸盐，触发记忆设备和记忆设备的cI/cro双稳态遗传开关。这可能允许在症状恶化之前检测肠道器官的疾病发生。 生物传感器是合成生物学方法中处理环境线索的重要组成部分。然而，能用于监测微生物组内部状态的生物传感器数量仍然有限。为了克服这个问题，Naydich等人开发了一种高通量记忆系统，可用于筛选在小鼠肠道中起作用的生物传感器。他们将cI/cro双稳态拨动开关作为记忆设备。在记忆关闭状态下，cI抑制因子占主导地位，而cro和下游lacZ表达关闭。触发装置由目标条件触发的候选启动子下cI的显性阴性突变体(cIDN)组成，cIDN的DNA结合区有一个N55K突变，与野生型(WT) cI形成二聚体并抑制cro和lacZ的表达。一旦cro表达足够高，即使没有刺激，cro也可以继续抑制cI。因此，生成触发器设备库后，高通量记忆系统可用于筛选在目标条件下活跃的启动子。他们测试了这种高通量记忆系统以筛选对炎症小鼠肠道环境反应增加的启动子。这项研究说明了如何将合成生物学方法作为调查工具。

4.2.4生物控制和药物输送的杀灭开关

随着开发微生物作为治疗剂的研究取得进展，出现了与转基因生物的生物安全有关的问题，这引起了人们对潜在危险生物材料向环境传播的风险增加的担忧。因此，实施有效的生物控制系统对于现实世界的使用至关重要，特别是使用在野生环境中比常用的实验室菌株更具抗性的工程野生型共生微生物的情况下。已经通过合成生物学方法制定了许多生物控制战略。最简单的方法是引入营养缺陷突变，其中微生物被设计成依赖于特定的营养物质进行生长。然而，营养缺陷菌株可以在提供营养的自然环境中存活。因此该方法只能用于可在体外分离和培养的微生物。所以杀灭开关可以作为生物控制的替代策略。 杀灭开关长期以来一直用于合成生物学。1987年，Molin等人通过在色氨酸抑制的Trp启动子下表达Hok基因，开发了一种条件杀灭开关。Hok基因使细胞膜去极化并导致细胞死亡。他们发现，Hok可以在广泛的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中起作用。2016年，Chan等人开发了被动激活的“deadman”和“passcode”杀灭开关。deadman开关激活毒素基因，并在缺乏信号(ATc)的情况下使必需基因失活。为了提高鲁棒性，在deadman开关中实现了遗传拨动开关(图7A)。另一方面，passcode杀灭开关采用了混合LacI-GalR家族TFs，允许控制细胞死亡的多个输入分子(图7B)。他们发现，在长期培养后IS1和IS5的丢失导致密码电路中大量的失活突变，增加了passcode的稳定性。

图7. (A) deadman杀灭开关的遗传回路。拨动开关的输出激活毒素并使杀死细胞的必需基因失活，这可以通过IPTG诱导。随后Mf-lon蛋白酶降解lacI和必需基因，以增加电路稳定性。(B) password杀灭开关的遗传回路。A、B和C代表抑制基因。输入a或b的缺失或输入c的增加激活毒素基因的表达。

4.3 底盘工程

为促进所需微生物的细胞重编程，必须将相关的遗传回路引入微生物中。这种微生物通常被称为“底盘”，该术语基于设备和机器(如汽车)的结构框架。据此，微生物通常用质粒转化以引入新功能，而不会改变其基因组DNA。事实上，早期的许多概念验证研究都是通过基于质粒的方法完成的。基于质粒的方法存在的问题包括质粒DNA的稳定性较低以及细胞间拷贝数差异引起的表达噪声。因此，将遗传部分或设备整合到底盘基因组DNA中是优选做法，特别是用于治疗目的。此外，底盘工程能够去除或增强生物体特征，以设计出更合适的用于治疗目的底盘。尽管底盘开发具有优势，但共生微生物的遗传操作仍然落后于E. coli和S. cerevisiae等模式生物，这两者都不是人类微生物组的主要成员。在本小节中，我们将回顾当前基于CRISPR的微生物基因操作和原位DNA转移方法的发展，这些方法允许对遗传难处理微生物进行遗传修饰。

4.3.1基于CRISPR的基因编辑/操作工具

CRISPR最初是作为古细菌的免疫系统被发现的，尽管现在它被认为是一种遗传学工具。CRISPR主要通过引入DNA断裂进行基因编辑，然后利用供体DNA进行同源重组。CRISPR导向的同源重组加速了许多生物体的基因组工程，包括那些以前被认为难以操纵的基因组。目前，CRISPR工具可用于多种共生细菌和酵母的定点诱变和基因缺失/插入，例如大肠杆菌、乳杆菌、梭菌、拟杆菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、酵母菌和念珠菌。CRISPR还被用于设计微生物组和共生微生物，以表征微生物组相关表型的基因功能。Guo等人使用CRISPR/Cas9证明了宿主免疫反应与梭菌产生的SCFAs之间的潜在联系。在这项研究中，Guo等人开发了一种CRISPR/Cas9系统，用于操纵Clostridium sporogenes并删除SCFA相关基因，导致SCFA产生减少。通过比较用野生型菌株和敲除菌株给药的小鼠的免疫反应，发现SCFA的缺失使IgA浆细胞增加。这支持了SCFA的免疫调节功能。最终，该研究表明基于CRISPR的微生物组遗传学可以帮助识别合成生物学方法所需的因果基因及其相互作用。 尽管CRISPR驱动的基因编辑广泛应用于许多生物体中，但在大多数同源重组活性有限的共生微生物中，由CRISPR/Cas9引起的DNA断裂往往导致细胞死亡，而不是基因编辑。因此，CRISPR/Cas9不能用于大多数非模式共生菌。对于这些微生物，CRISPRi、CRISPRa或碱基编辑器可能是毒性较小的替代品。CRISPRi和CRISPRa是调节转录活性(而不是编辑基因)的工具。这两种工具都采用具有DNA结合活性而非DNase活性的dCas9，分别与转录抑制因子或激活因子融合以调节sgRNA识别位点附近的转录。因此，CRISPRi和CRISPRa作为可编程转录因子，理想情况下可以靶向任何基因的启动子，其可编程性允许使用CRISPRi文库对细菌进行敲除筛选。因此，Peters等人构建了一个CRISPRi文库，该文库涵盖了B. subtilis用于功能筛选的所有必需基因，并确定了抗生素的作用机制。 CRISPRi和CRISPRa具有很高的可编程性，因此其可以用作构建遗传回路的自定义转录因子。此后，构建出了许多基于CRISPR的合成基因回路。使用CRISPRi和CRISPRa成功合成多个逻辑门、缓冲区、NOT、AND、OR、NAND、NOR、XOR和NIMPLY。除了合成逻辑门，CRISPRi和CRISPRa也实现了双稳态拨动开关、振荡器等合成基因电路。到目前为止，虽然CRISPRi和CRISPRa构建的大多数遗传回路都是在E. coli或S. cerevisiae中，但这种方法也可促进非模式生物中遗传回路的构建。 CRISPR/Cas9基因编辑通过DNA链断裂和随后的同源重组引入突变，而碱基编辑器使用脱氨酶使DNA突变。碱基编辑器使用dCas9或切口酶Cas9融合到可以转换核苷酸的脱氨酶上。例如，胞嘧啶碱基编辑器将C转换为G，而腺嘌呤碱基编辑器促进A到T的转换。由于碱基编辑是一种新技术，目前还没有将其用于微生物组工程的研究。然而，与使用细菌相比，使用碱基编辑器编辑微生物组的毒性较低，预计将很快应用于治疗。 另一个有前景的微生物组工程CRISPR相关工具是CRISPR相关的Tn7转座子(CAST)。2017年Peters等人首次报道了CAST。他们发现一些细菌携带Tn7样转座子，包括CRISPR亚型I-F的Cas效应蛋白。Tn7样转座子缺乏介导Tn7转座子的目标插入的TnsE。因此研究者假设这种类型的转座子劫持并利用CRISPR系统进行DNA识别，通过CRISPR介导的方式进行CAST转置。2019年，两个团队都证明了CAST以CRISPR介导的方式插入大肠杆菌的靶位点。两者都表明可以通过改变gRNA序列来重编程靶位点。Strecker等人的结果显示DNA插入效率在不进行任何选择的情况下可以达到80%，脱靶插入频率<1%。根据研究结果，插入效率高度依赖于目标位点。Strecker团队还在测试的48个位点中检测到29个位点的靶向插入。2022年，Rubin等人应用CAST开发了DNA编辑一体式RNA引导的CRISPR-Cas转座酶(DART)系统，该系统在小鼠肠道微生物群落中具有位点和物种特异性。 总而言之，CRISPR能够操纵多种基因组DNA。DNA传递仍然是下游过程实验操作的第一步，但大多数共生微生物是不可培养的。因此，下一节将回顾微生物群原位基因操作的当前进展。

4.3.2微生物的原位遗传操作

如第2节所述，多组学研究揭示了微生物群基因如何与多种人类疾病和健康状况相关。然而，阐明微生物群基因与宿主疾病的因果关系仍然很困难，主要是由于在非模式微生物群中进行遗传操作的困难以及体外培养存在的挑战。而化学转化和电穿孔等传统DNA递送方法只能在体外应用。因此，在微生物组工程中将DNA原位转移到微生物群中的替代技术越来越受欢迎。 为了适应不同的条件，环境细菌在不同物种之间积极交换质粒DNA，这一过程称为水平基因转移(HGT)。最广泛使用的HGT方法之一是细菌接合，通过IV型分泌系统将质粒DNA从供体细菌转移到受体细菌。肠道微生物群被认为是接合基因转移的良好环境。据报道，细菌接合可用于来自不同供体的肠道微生物群的原位操纵。作为一种微生物组工程工具，最近细菌接合变得越来越重要。Ronda等人开发了一种称为通过原位接合改变肠道微生物组宏基因组(MAGIC)的技术，该技术能够使用Inc.Palpha家族RP4接合系统将大肠杆菌供体菌株的质粒DNA原位转移到肠道微生物群。该系统允许他们将DNA引入革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。编码转座子和转座盒的结合质粒将DNA原位整合到基因组DNA中。荧光激活细胞分选(FACS)和16S RNA分析表明，至少有5%的肠道细菌被成功地原位修饰。然而，72小时后接合子将不再被检测到，可能是由于毒性或载体不稳定。因此，需要进一步改进MAGIC，以用于肠道微生物群的稳定基因组操作，以研究和鉴定微生物组相关疾病的致病基因。 另一种将DNA原位转移到复杂群落细菌中的方法是使用噬菌体。噬菌体是感染特定细菌并将其基因组DNA转移到细菌细胞中的病毒。感染后，噬菌体来源的质粒DNA被整合到宿主基因组DNA中或在宿主中复制。通过将所需的DNA片段克隆到噬菌体的基因组DNA中，外源基因可以转移到细菌细胞中，在那里它们以相当高的效率赋予新功能。值得注意的是，P2噬菌体的转导效率可以达到接近100%，远远超过其他DNA传递方法。由于噬菌体具有靶标特异性、高效性和原位活性等特点，在微生物组工程中得到了广泛的应用。Lam等人证明噬菌体可以将CRISPR/Cas9盒传递到小鼠肠道的大肠杆菌中，表明由噬菌体原位递送的CRISPR/Cas9可能导致染色体大量缺失。 由于没有适用于所有共生微生物的通用DNA转移方法，因此了解遗传易感微生物并为感兴趣的微生物选择最佳的原位DNA转移方法至关重要。Rubin等人开发了环境转化测序(ET-seq)和DNA编辑一体式RNA引导的CRISPR-Cas转座酶(DART)系统，这些技术允许在微生物群落中鉴定遗传可处理的细菌以及原位生物体和位点特异性遗传操作。在ET-seq中，含有非靶向mariner转座子的DNA通过接合、电穿孔或自然转化转移到微生物群落，之后通过深度测序鉴定转座子整合位点。在鉴定可处理细菌和最佳DNA传递方法后，设计了生物体和位点特异性CRISPR相关转座酶质粒，并将其引入土壤和婴儿肠道微生物群中。利用DART靶向大肠杆菌的菌株特异性基因组位点，并证明DART可以改变大肠杆菌菌株组成。另一个优化DNA操作的例子是由Jin等人完成的。他们开发了一种在体外和宿主中操纵非模型肠道微生物群(梭菌)的工具。他们的工具包括鉴定兼容的rep和ori载体组合，大肠杆菌和梭菌的抗体选择，最后是减少限制性修饰以提高稳定接合和基因组修饰的稳定性。

5挑战和限制

在第2节中，本文回顾了微生物组研究，这些研究表明微生物组与疾病/健康状态之间存在联系。这些研究表明，微生物组通过微生物组与宿主的相互作用在人类健康中发挥至关重要的作用。第3节回顾了微生物组的组成和功能改变如何影响人类健康状况，表明微生物组可能是多种疾病的促成因素。揭示疾病中微生物组的因果关系使其可通过各种策略进行调控。然而，微生物组工程疗法尚未产生可行的商业产品。虽然在某些病例中我们正在等待临床评估的结果，但由于疗效的缺乏，其他疗法(特别是工程细菌疗法)迄今为止无法在临床试验中取得好结果。

因此，作者提出了阻碍利用工程微生物组疗法治疗疾病的可行性的三个限制：

(1)缺乏微生物组相关疾病的多层次机制理解；

(2)改变遗传难处理生物体所面临的挑战；

(3)工程微生物组的时空调控。

在第4节中，我们回顾了可以帮助解决这些局限性的元组学研究和合成生物学工具的当前进展。尤其是代谢组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和多元组学方法，能够在代谢物、基因和基因相互作用水平上进行关联研究，从而加深我们对微生物组相关疾病的分子机制的了解，并允许设计针对特定靶标的可预测和调节行为的重编程微生物。此外，使用细菌接合和噬菌体的CRISPR和原位DNA转移技术允许在体外和原位操纵遗传难处理微生物。 本文还回顾了合成生物学中来自工程领域的常见设计原则如何促进具有合成遗传回路的工程微生物的时空调节。虽然大多数实验是在体外条件下进行的，但也有些实验应用于肠道微生物组，证明了微生物组环境中时空调节的可行性。 如前所述，功能元组学和合成生物学方法有助于解决阻碍工程微生物治疗可行性的限制。然而，因为合成生物学的出现独立于微生物组研究，实验工具仍需专门用于研究微生物组。因此大多数可用的工具都是为大肠杆菌设计的，以便在恒定的实验室条件下研究。迄今为止，非模式共生微生物组的标准化遗传部分的收集仍然有限或无法实现。例如，最初大肠杆菌基因部分是为体外目的而开发的，所以它们在微生物组环境中的大多数功能没有得到很好的评估，可能导致遗传回路稳定性的丧失。由于个体中发现的微生物组多样性，稳健的设计对于治疗应用至关重要。因此，体外平台(如器官芯片和类器官)的发展将加速体内环境遗传部件和基因回路的优化。

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