低聚半乳糖的检测定量方法

低聚半乳糖的检测定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量的方法。
【背景技术】
[0002] 低聚半乳糖是W半乳糖为主要成分的结合方式不同的寡糖的混合物，一般，通过 在乳糖中进行基于e-半乳糖巧酶的转移反应而制造。作为低聚半乳糖的生理效果，被报道 了使在肠道内生存的乳酸杆菌增加来调理肠内环境的效果、通过减少肠间膜脂肪而有助于 预防生活习惯病等效果，作为特定保健用食品、各种功能性食品或者它们的原材料，从W前 开始就被重视。在作为特定保健用食品等的成分使用低聚半乳糖的情况下，为了保证其品 质、规格、对作为功能性成分的定量分析数据进行表示等，要求确立正确性高的定量法。
[0003] 对饮食品中的低聚半乳糖进行定量的方法有如下方法:使0-半乳糖巧酶作用于低 聚半乳糖，对由酶解产生的半乳糖进行定量，算出寡糖(非专利文献1)。但是，生成的半乳糖 的检测需要使用安装有昂贵的脉冲型电化学检测器的阴离子交换高效液相色谱，有通用性 低的问题。另外，在饮食品中含乳糖等营养成分的情况下，不能对由酶处理产生的半乳糖和 从乳糖游离的半乳糖进行判断，结果是，低聚半乳糖的定量精度下降。
[0004] 也存在如下方法:对低聚半乳糖中的特征性成分、例如少-半乳糖基乳糖(少-GL Gaiei-4Gaim-4Glc)进行定量，根据其量进行逆运算，算出低聚半乳糖的总量。该方法可判 明使用的低聚半乳糖中的少-CiL的含量，在该含量稳定而没有批次差异等的情况下特别有 效。作为对饮食品试样中的少-化进行定量的方法，W往主要使用如下方法:利用凝胶渗透 色谱，根据分子的尺寸将饮食品中的其他成分和少-CiL分离。
[0005] 但是，如上所述，低聚半乳糖大多使用营养成分丰富的饮食品、例如育儿用调制奶 粉、发酵乳制品等作为功能性的原材料，在该饮食品中也大多含分子的大小与少-CiL同等的 糖质源，所W在凝胶渗透色谱中不能将那些糖质源和少-化分离。例如，在想要用凝胶渗透 色谱对含作为糊精所含的一种糖类的麦芽=塘的饮食品中的少-CiL进行分离和定量的情况 下，因为麦芽S塘和少-化的分子大小相同，所W从柱洗脱后的两者的峰重合，因此给少-GL 的定量、即低聚半乳糖的定量带来障碍。
[0006] 作为用反向色谱检测寡糖的方法，已知使用C8或者C18反相色谱柱的方法(专利文 献1)。但是，在使用运些柱尝试进行饮食品中的低聚半乳糖的分离的情况下，不能将饮食品 的其他成分和低聚半乳糖成分分离。
[0007] 现有技术文献 [000引专利文献
[0009] 专利文献1:特表2007-523352号公报
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献IiJournal of AOAC InternationaliVolume 85 ,Number 2 ,March 2002,pp.417-423(7)

【发明内容】

[0012] 因此，本发明的目的在于：提供从含低聚半乳糖和糊精的试样中简单且低成本地 分离少-CiL并对少-CiL和低聚半乳糖正确地进行定量的方法。
[0013] 本发明人为了解决上述问题进行了锐意研究，结果发现:通过使含低聚半乳糖和 糊精的试样与衍生物化试剂反应，使所述试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着，提供 于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱，从而能将该试样中的低聚半乳糖成分充分分离，由 此完成了本发明。
[0014] 目P，本发明提供低聚半乳糖的检测定量方法，其对含低聚半乳糖和糊精的试样中 的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与 衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱 的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。
[0015] 根据本发明的检测定量方法，能简单地W低成本将试样中的低聚半乳糖和其他成 分分离，能正确地进行低聚半乳糖的定量。通过使用本发明的方法对饮食品等的低聚半乳 糖进行检测定量，能对该饮食品等所含的低聚半乳糖的量正确地进行管理，能保证品质，并 且能正确地进行各种有效性试验数据的取得、表示等。
【附图说明】
[0016] 图1是使用凝胶渗透柱的HPLC的色谱图。
[0017] 图2是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)。
[001引图3是PMP衍生物-反相HPLC色谱图（C18反相柱）。
[0019] 图4是PMP衍生物-反相HPLC色谱图（C8反相柱）。
[0020] 图5是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)，憐酸钟缓冲液(pH4)/C出CN(78/22)。
[0021] 图6是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)，憐酸钟缓冲液(P册)/C出CN(79/21)。
[0022] 图7是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)，憐酸钟缓冲液(pH7)/C出CN(81/19)。
[0023] 图8是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)，憐酸钟缓冲液(pH7)/C出CN(82/18)。
[0024] 图9是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)，憐酸钟缓冲液(P册)/C出CN(82/18)。
[0025] 图10是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)，憐酸钟缓冲液(P册)/C出CN(83/17)。
[0026] 图11是PMP衍生物反相HPLC色谱图（C30)。
【具体实施方式】
[0027] 本发明的检测定量方法是如下方法:在使饮食品等试样中所含的低聚半乳糖衍生 物化的基础上提供于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱化PLC)，对试样中的其他成分和 低聚半乳糖进行分离和定量。低聚半乳糖用通式:Gal-(Gal)n-Glc(其中，式中Gal是半乳糖 残基，Glc是葡萄糖残基，n是0~4的整数)表示，是在分子内含一分子W上半乳糖的2~6糖 的混合物。其中，乳糖不含于低聚半乳糖中。
[0028] 低聚半乳糖的主要成分是在乳糖的非还原末端键合有1个半乳糖的3糖的少-半乳 糖基乳糖(4'-GL)。作为其他的具体成分，可列举Gaim-3Glc、Gaiei-2Glc、Gaim-6Glc、Gal ei-6Gaim-4Glc、Gaiei-6Gaim-4Gaiei-4Glc、Gaim-4Gaiei-4Gaiei-4Glc 等。在本发明的 检测定量方法中，可W将低聚半乳糖作为混合物对其进行检测定量，也可W对各个低聚半 乳糖成分进行检测定量，但是从定量的精度的方面出发，优选在-化为对象将其分离后 进行检测定量，根据其量进行逆运算，算出低聚半乳糖的总量。
[0029] 低聚半乳糖W任何方法得到均可，例如，能使用W乳糖为原料，通过基于乳糖分解 酶(e-半乳糖巧酶）的转移反应而制成的低聚半乳糖。也可W在转移反应中，使产生酶的微 生物作用于原料。作为含乳糖的原料，例如可列举市售的乳糖、乳汁、奶粉、干酪乳清等。使 用的酶只要是能得到低聚半乳糖的酶就没有特别限定，例如可列举使原料中的乳糖水解， 使通过分解产生的半乳糖转移到乳糖或葡萄糖的酶，具体地可列举e-半乳糖巧酶、Q-半乳 糖巧酶。运些酶能单独使用或者组合巧巾W上使用。酶处理条件没有特别限定，一般原料浓 度是10~70%，pH是3~8，酶浓度是0.01~100units/ml，溫度是20~7(rC，反应时间是2小 时~3天较合适。另外，也能使用市售的低聚半乳糖液糖，例如能列举化IGOMATE 55N(才IJj' 斗H55N)(日本养乐多药品工业株式会社）。另外，也能使用从含低聚半乳糖的天然物中利 用通用方法进行离析、精制而得到的低聚半乳糖。含低聚半乳糖的天然物的种类没有任何 限定，可列举例如哺乳动物的乳汁。
[0030] 在本发明中，成为低聚半乳糖的检测定量的对象的试样只要含低聚半乳糖和糊精 就没有特别限制，可列举特定保健用食品、功能性食品、健康食品、营养补充食品、婴儿用、 幼儿用、孕产妇用、病人用的特殊用途食品、吞咽困难者用食品、育儿用调制奶粉等饮食品、 它们的原材料、或者医药品等。其中，在含糖质成分较多的育儿用调制奶粉应用本发明的方 法的情况下，能高精度地进行低聚半乳糖的检测定量，因此优选。所谓糊精是3分子W上的 葡萄糖聚合的物质的统称。另外，作为糊精的一种有麦芽糊精，所谓麦芽糊精是D-葡萄糖利 用曰-1，4键而聚合的聚合物，葡萄糖当量不足20，通过淀粉水解而得到。
[0031] 麦芽糊精含由3分子的葡萄糖构成的麦芽=塘、4分子的葡萄糖聚合的4糖、或者其 W上的葡萄糖聚合的多聚糖类。麦芽=塘是3分子的葡萄糖聚合的物质，分子量和分子尺寸 与少-化相同，一部分径基的立体结构不同。在饮食品等试样中存在与运样的少-化相同大 小的分子的情况下，在凝胶渗透色谱等的现有方法中，将少-化和麦芽S塘等分离，不能对 低聚半乳糖进行定量，但是根据本发明的方法，能将两者充分地分离。所谓葡萄糖当量是将 试样中的还原糖表示为葡萄糖并作为相对于固体成分的百分率求出的值。葡萄糖当量最大 为100,是指全部固体

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