一种抑制麦芽糖化过程中脂肪氧合酶活性的测定方法与流程

本发明涉及一种测定方法，具体涉及一种抑制麦芽糖化过程中脂肪氧合酶活性的测定方法。

背景技术：

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX)属于氧化还原酶类，是一种蛋白酶内含非血红素铁、对于具有顺，顺-戊二烯构型的多不饱和脂肪酸可以发生特定的催化作用、产物是一种具有共轭双键的氢过氧化合物。脂肪氧合酶广泛存在于动植物界，研究发现在大麦麦芽中同时存在LOX1酶和LOX2酶两种类型的同工酶，LOX1酶主要存在于大麦的胚芽中，而LOX2酶是在大麦发芽后才生成的。

研究认为LOX1在麦芽糖化过程中，作用于不饱和脂肪酸9-HPOD(9-脂肪酸氢过氧化物)，然后在裂解酶的作用下最终生成反-2-壬烯醛(T2N)；LOX2作用于不饱和脂肪酸生成13-HPOD(13-脂肪酸氢过氧化物)，然后在裂解酶的作用下生成己醛。LOX酶作为脂质氧化途径的关键性酶和限速性酶，已经成为全球啤酒研究的焦点。

然而，对于LOX酶抑制剂的研究表明，除了已研究清楚的四种抑制机理-与底物竞争酶的活性部位、螯合作用、还原作用和竞争脂质自由基外，尚还有一些抑制机理并未研究清楚。

综上，基于脂肪氧合酶在脂质氧化途径中的关键性以及其抑制机理的尚不完全清楚性，如何能够有效地控制脂肪氧合酶的活性，进而控制啤酒老化以提高啤酒的可饮性，将是本领域研究的重要课题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抑制麦芽糖化过程中脂肪氧合酶活性的测定方法，能够有效地控制脂肪氧合酶的活性，有利于控制啤酒老化，提高啤酒的可饮性。

本发明提供了一种抑制麦芽糖化过程中脂肪氧合酶活性的测定方法，包括如下步骤：

将麦芽粉加入到水中，按照协定麦汁法对其进行糖化；

移取糖化过程中不同反应时间段的发酵液，离心取上清液，得到粗脂肪氧合酶；

向磷酸盐缓冲液中依次加入亚油酸、抑制剂和粗脂肪氧合酶，得到抑制剂抑制的粗脂肪氧合酶；

以含有亚油酸、抑制剂的磷酸盐缓冲液作为空白，测定抑制剂抑制的粗脂肪氧合酶在不同时间段的吸光度，得到抑制剂作用的脂肪氧合酶活性。

作为可选方案，移取糖化过程中不同反应时间段的发酵液50-100ml，10000-14000rpm离心8-12分钟，移取1-2ml上清液，得到粗脂肪氧合酶。

作为优选方案，向磷酸盐缓冲液中依次加入的亚油酸、抑制剂和粗脂肪氧合酶的体积比为1:1:1-1:3:1。

作为优选方案，所述抑制剂选自奎诺二甲基丙烯酸酯、去甲二氢愈创木酸和水杨羟肟酸中的至少一种。

作为可选方案，测定的吸光度的范围为220nm-240nm。

作为可选方案，糖化过程中不同反应时间段分为糖化过程的早期、中期、末期反应时间段，其中，所述早期为反应开始0分钟时，所述中期为反应开始0-15分钟时，所述末期为反应开始15-30分钟时。

本发明提供了一种抑制麦芽糖化过程中脂肪氧合酶活性的测定方法，相比于现有方法而言，本申请所提供的方法主要是利用化学试剂来测定麦芽糖化过程中受到抑制剂作用的脂肪氧合酶活性。相对于利用转基因手段，更易于操作，且不会受到转基因食品的影响，更容易被人们接受。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的不添加抑制剂的脂肪氧合酶吸光度变化图；

图2为本发明实施例所提供的添加喹诺二甲基丙烯酸酯后脂肪氧合酶吸光度变化图；

图3为本发明实施例所提供的添加水杨羟肟酸后脂肪氧合酶吸光度变化图；

图4为本发明实施例所提供的添加去甲二氢愈创木酸后脂肪氧合酶吸光度变化图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种抑制麦芽糖化过程中脂肪氧合酶活性的测定方法，包括如下步骤：

S1：将麦芽粉加入到水中，按照协定麦汁法对其进行糖化；

S2：移取糖化过程中不同反应时间段的发酵液，离心取上清液，得到粗脂肪氧合酶。

本步骤主要是为了获得可用于后续处理分析的粗脂肪氧合酶，在本步骤中，提取了不同反应时间段的糖化过程中的发酵液以进行平行性分析，从而有利于明确获知在哪个反应时间段，抑制剂对脂肪氧合酶作用更强。

S3：向磷酸盐缓冲液中依次加入亚油酸、抑制剂和粗脂肪氧合酶，得到抑制剂抑制的粗脂肪氧合酶。

在本步骤中，对上述得到的粗脂肪氧合酶进行进一步处理，主要是通过向磷酸盐缓冲体系中依次加入亚油酸、抑制剂与粗脂肪氧合酶。其中，加入亚油酸是为了给粗脂肪氧合酶提供反应底物，加入抑制剂是为了抑制脂肪氧合酶活性。

S4：以含有亚油酸、抑制剂的磷酸盐缓冲液作为空白，测定抑制剂抑制的粗脂肪氧合酶在不同时间段的吸光度，得到抑制剂作用的脂肪氧合酶活性。

在本步骤中，根据吸光度的变化，从而确定不同抑制剂对脂肪氧合酶的抑制程度。

在一可选实施例中，移取糖化的不同反应时间段的发酵液50-100ml，10000-14000rpm离心8-12分钟，移取1-2ml离心后得到的上清液，得到粗脂肪氧合酶。在本实施例中，主要是对发酵液的处理，具体为获得粗脂肪氧合酶，以用于后续的进一步处理中。可以理解的是，本实施例并不局限于上述所列举的具体参数，本领域技术人员可依据实际反应情况进行调整，例如对于发酵液的体积还可以为60、70、80、90ml、离心的转速还可以为11000、12000、13000rpm，离心时间还可以为9、10、11分钟等，可移取1、1.5、2ml上清液，只要能够获得有利于后续分析的粗脂肪氧合酶干燥粉末即可。

在一优选实施例中，作为优选方案，向磷酸盐缓冲液中依次加入亚油酸、抑制剂和粗脂肪氧合酶的体积比为1:1:1-1:3:1。在本实施例中，说明了加入亚油酸、抑制剂、粗脂肪氧合酶的具体体积以及相应的具体步骤。可以理解的是，本实施例中的亚油酸、抑制剂和粗脂肪氧合酶的体积比还可以为1:2.5:1、1:2:1、1:1.5:1等，本领域技术人员可根据实际反应情况进行调整。

在一优选实施例中，所述抑制剂选自奎诺二甲基丙烯酸酯、去甲二氢愈创木酸、水杨羟肟酸中的至少一种。可以理解的是，本实施例并不局限于上述所列举的抑制剂，还可以是本领域所常用的其他类似抑制剂。

在一优选实施例中，测定的吸光度的范围为220nm-240nm。本实施例具体说明了测定脂肪酶活性的条件，所选用的条件参数为分析脂肪酶活性的优化参数，所使用的分光光度计为Cary-100紫外-可见分光光度计。

在一可选实施例中，糖化过程中不同反应时间段分为糖化过程的早期、中期、末期反应时间段，其中，所述早期为反应开始0分钟时，所述中期为反应开始0-15分钟时，所述末期为反应开始15-30分钟时。在本实施例中，对糖化过程中的不同反应时间段进行了限定，具体的，可根据整个反应周期、以及不同反应阶段中抑制剂对粗脂肪氧合酶作用的程度确定时间段的划分，例如可划分为反应没有开始抑制的阶段、反应进行了一段时间已部分抑制的阶段、反应后期已全部抑制的阶段，根据上述阶段，可将时间段划分为0分钟、0-15分钟、15-30分钟。可以理解的是，在不同的反应条件、外界因素影响下，反应程度会有所不同，在这种情况下，本领域技术人员可根据上述划分依据优化时间段的划分，以清楚明确哪个阶段对粗脂肪氧合酶作用的抑制性更强。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的抑制麦芽糖化过程中粗脂肪氧合酶活性的测定方法，现将结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

将5g麦芽粉加入20mL蒸馏水，于47℃下按照协定麦汁法对其进行糖化；在40℃下，分别移取糖化过程中早期0分钟、中期0-15分钟、末期15-30分钟的发酵液2ml，12000rpm、4℃条件下离心8分钟，取1mL上清液，制得粗脂肪氧合酶；按照表1的量在磷酸盐缓冲液中先后加入亚油酸、抑制剂、粗脂肪氧合酶；将磷酸盐缓冲液、亚油酸底物、抑制剂混合物作为空白，调零后加入50μL的粗脂肪氧合酶提取液，在235nm下测量吸光度，分别计时1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，得到抑制剂作用的粗脂肪氧合酶的吸光度变化曲线，以对照A组为例，参见图1-4。

表1 测试中的各种试剂加入量

由对比文件A组(图1-4)、以及对比文件B组和C组的吸光度值变化规律可以看出，三种抑制剂对脂肪氧合酶的活性均起到了一定的抑制作用，其中，水杨羟肟酸与去甲二氢愈创木酸的抑制作用明显优于奎诺二甲基丙烯酸酯。

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