益生菌可通过调节肠道菌群介导不同宏基因组途径产生抗肥胖作用

编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

肥胖在世界范围内日益流行，葡萄糖转运体（gluts，主要是glut1和glut4）是脂肪特异性甘油三酯储存的重要决定因素，与肥胖有关。益生菌是活的微生物，当摄入足够时，对人类产生有益作用，部分益生菌具有降血糖和抗肥胖作用，可调节glut介导的葡萄糖摄取。干酪乳酪杆菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，LCZ）先前被证实对摄入高热量的大鼠可以降低血脂和防止血糖受损,然而肠道微生物群如何调控glut1及葡萄糖摄取活性的机制尚未阐明。

本实验旨在研究肠道绒毛特异性glut1在肥胖中的作用，以及在没有肠道绒毛特异性glut1表达的情况下，LCZ干预的抗肥胖作用机制，比较了高脂饮食喂养的绒毛特异性glut1敲除（KO）小鼠和经过或不经过LCZ干预对照组小鼠（glut1 flox/flox）之间的体重、肠道菌群扰动、脂肪质量积累和葡萄糖耐量（通过口服葡萄糖耐量试验），并通过宏基因组测序来评价肠道微生物群。结果显示，与对照组小鼠相比，绒毛特异性glut1 KO小鼠在中期前期有更多的脂肪沉积，糖耐量受损，肠道微生物群有明显的改变。益生菌显著降低了KO型和对照组小鼠的体重、肠系膜和肾周白色脂肪组织（WAT）的重量，并调节其肠道微生物群。结果表明消除肠道上皮细胞glut1的活性会影响肠道菌群、脂肪积累和葡萄糖耐量，使用LCZ可减少脂肪积累和中心性肥胖。

论文ID

原名：Lactobacillus casei Zhang exerts anti-obesity effect to obese glut1 and gut-specific-glut1 knockout mice via gut microbiota modulation mediated different metagenomic pathways

译名：干酪乳酪杆菌Zhang通过调节肠道菌群介导不同宏基因组途径对肥胖glut1和肠道特异性glut1产生抗肥胖作用

期刊：European journal of Nutrition

IF：5.614

发表时间：2022.1.4

通讯作者：张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1007/s00394-021-02764-0

实验设计

所有小鼠（8周龄）均被喂食高脂饮食（脂肪60%千卡，碳水化合物20%千卡，蛋白质20%千卡），共有5组小鼠（图1），LCZ干预组的小鼠每日灌胃4x109CFU活菌，其他两组每日注射等量的生理盐水。所有小鼠在第21周被处死，收集合并附睾、肾周和肠系膜的白色脂肪组织（WAT）并进行称重。小鼠肠系膜脂肪样本均在4%多聚甲醛中固定48h，用乙醇和二甲苯梯度脱水后，将组织包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，用苏木精和伊红对石蜡切片染色，然后进行光学显微镜检查。为了进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），葡萄糖灌胃剂量为每公斤体重2g，在灌胃前（空腹12h）和灌胃后15、30、45、60、90、120min采用Accu血糖监测仪检测小鼠血糖水平。使用商业试剂盒从小鼠尾巴中提取基因组DNA，采用引物对2.85F/2.9R和creF/creR进行PCR检测，确定动物glut1基因型。使用QIAamp DNA stool mini kits 从粪便（所有五个组）和小肠内容物（2个KO小鼠组）中提取细菌总DNA。使用超过1μg的高质量DNA 和NEBNext ultra DNA文库制备试剂盒构建DNA文库。构建的测序文库用索引码进行标记，文库的制备工作在Illumina HiSeq平台上进行测序。对于GV和GVP中的小肠菌群，使用PacBio RSII仪器对16S rRNA基因进行测序，并根据之前的研究进行分析。

图1 实验设计示意图【小鼠每日用生理盐水或LCZ（4×109CFU）灌胃13周】。

前言

肥胖是各种代谢性疾病的主要危险因素，包括代谢综合征和Ⅱ型糖尿病。世界上超过一半的人口超重，中心性肥胖比一般肥胖具有更高的代谢紊乱和冠心病的风险，其特点是腹腔内脏（网膜和肠系膜）堆积，而对中心性肥胖的评估是基于腰围、腰臀比和体重指数。肠系膜脂肪厚度是代谢综合征所有组成部分的独立决定因素，被认为是脂肪肝、代谢综合征和多囊卵巢综合征的指标。与皮下和腹膜前脂肪厚度相比，肠系膜脂肪厚度与心血管危险因素也表现出更强的相关性。在动物研究中发现高脂肪饮食可诱导肠系膜脂肪的积累，因此肠系膜脂肪是导致肥胖发展和并发症的主要原因。

葡萄糖是在甘油三酯（TG）中构建甘油酯-甘油主干所必需的。葡萄糖从肠道和其他组织摄取脂肪细胞的速率影响TG积累，很明显肠系膜脂肪与肠道紧密相连。葡萄糖转运体（glut1）损伤被认为是脂肪积累和葡萄糖耐量的一种机制，glut1在体内具有多种生理功能，包括维持全身的葡萄糖稳态，特别是在大脑、肌肉、脂肪、肠道和神经元系统中。首先，大脑葡萄糖转运受损多见于glut1缺乏症的儿童，而glut1活动的缺乏会导致癫痫、运动异常、认知障碍等疾病。其次，在癌症病例中glut1的表达在癌细胞中被高度激活，将葡萄糖大量输入细胞，以应对由于生长异常而导致的高局部能量需求。第三，glut1转运体的高表达与葡萄糖水平显著降低相关，提示其在葡萄糖转运中具有重要意义，这些观察结果表明，glut1可能是导致肥胖及其相关因素的一个重要靶点。尽管越来越多的证据表明葡萄糖摄取和肥胖之间存在密切联系，但很少有研究确定肠道微生物群在调节glut1中的作用，以及它们在导致肥胖中的交互作用。本研究旨在探讨肠道特异性glut1的表达是否对肥胖有任何影响，以及这种机制是否是通过肠道微生物群的调节。此外，这项研究还旨在寻找促进高脂肪诱导的肥胖关键微生物。通过对微生物宏基因组组成和途径的分析，探讨了干酪乳酪杆菌Zhang对肠道黏膜表面脂肪分布的有益影响。

实验结果

HFD喂养的绒毛特异性glut1 KO小鼠的体重大于对照组小鼠（GV vs GF，P<0.05；图2A，图S1A），而两组的体重在第18周后变得不显著（P>0.05；图2B）。经过13周的饮食干预后，接受LCZ处理的预防组或治疗组的小鼠比未接受小鼠体重低，这种趋势一直持续到实验结束（GFP和GFT，P<0.001；图2B，2C）。喂食LCZ和HFD的glut1 CKO小鼠的体重也明显低于只喂食HFD的glut1 CKO小鼠（GVP vs GV，P<0.001；图2B，2C）。LCZ预防组的glut1 fl/fl小鼠（GFP）相比非治疗组（GFT）在OGTT 30min时血糖水平显著下降（图2D；P<0.05）。与glut1 fl/fl小鼠相比，OGTT中绒毛特异性glut1 KO小鼠在30min时显示血糖水平急剧升高（P<0.05；图2D，2E）。然而LCZ并不能纠正LCZ治疗组glut1 CKO小鼠的血糖耐量异常（P>0.05；图2D，2E）。

图2  LCZ减少了野生型小鼠和绒毛特异性glut1敲除小鼠饮食诱导的肥胖和代谢紊乱。（A）实验设计。（B）不同组高脂饮食（HFD）喂养小鼠的体重，包括肥胖特征。（C）第21周时的体重。（D）口服糖耐量试验（OGTT），P<0.05*，GV和GF，P<0.05，GFP vs GF。（E）OGTT中30min时的血糖水平。P<0.05*；P<0.01**；P<0.001*** （原文图1）。

为了确定LCZ摄入是否减少不同部位的白色脂肪积累量，在第21周时对小鼠的脂肪组织、附睾、肾周和肠系膜脂肪（图3A，3B）称重。在LCZ处理的两种小鼠中，除eWAT之外，pWAT和mWAT的重量都显著降低（P<0.05或P<0.001）（图3C）。与HFD-glut1 CKO小鼠相比，HFD-glut1 fl/fl小鼠肾周脂肪的重量显著减少，而肠系膜脂肪的重量没有显著变化（图3C）。此外，在LCZ处理的两种类型的小鼠中，mWAT的脂肪细胞大小均显著减小（图3D，3E；P<0.001）。

图3 LCZ减少了野生型和绒毛特异性glut1 KO小鼠的脂肪质量和脂肪细胞大小。（A）肠系膜WAT和（B）肾周WAT的代表性图，比例尺200µm。（C）以HFD饮食喂养加/不加LCZ处理的五组小鼠三种不同类型的WATs的体重。5个组分别为：GV（n=6）、GVP（n=5）、GF（n=18）、GFP（n=18）和GFT（n=18）。（D）五组喂食HFD加/不加LCZ治疗的肠系膜WAT的苏木精和伊红染色切片代表性图像，比例尺200µm。（E）五组肠系膜WAT中脂肪细胞大小的比较。P<0.05*；P<0.01**；P<0.001***；NS不显著，（原文图2）。

野生型小鼠的结肠含高水平的Deferribacteres（P<0.05），而HFD喂养的绒毛特异性glut1 KO小鼠Actinobacteria的相对丰度高于其他组（图4A）。与LCZ处理组相比，HFD喂养的对照组小鼠和绒毛特异性glut1 KO小鼠的Firmicutes/Bacteroidetes比值显著降低（图4B；P<0.01），在属水平上，HFD喂养的glut1 CKO小鼠和glut1 fl/fl小鼠的Bacteroides 相对丰度降低，而该属通过LCZ干预富集。Ruminococcus在HFD喂养的glut1 CKO小鼠中大大减少，但在glut1 fl/fl小鼠中被富集，并且通过LCZ处理显著促进（图S2）。

主坐标分析表明，去除绒毛特异性glut1的表达对肠道菌群有深远影响。LCZ处理显著调节了肠道菌群（图4C），绒毛特异性glut1 KO小鼠表现出比对照组小鼠更高的细菌多样性（P<0.001），但在经过和不经过LCZ处理的小组之间没有发现显著差异（图4D）。然后鉴定了glut1特异性差异丰富的物种，与glut1 fl/fl小鼠相比，glut1 CKO小鼠中有3种（Mucispirillum schaedleri、Bacteroides intestinalis 、Ruminococcus gnavus）减少，4种（Faecalibaculum rodentium、 Barnesiella intestinihominis、Odoribacter splanchnicus、Odoribacter laneus）增加（图4E，图S3）。无论是否添加LCZ，在glut1 CKO小鼠中都发现了更多的Faecalibaculum rodentium 和Barnesiella intestinihominis。通过LCZ处理富集Oscillibacter valericigenes、Bacteroides uniformis、Acetatifactor muris（图4E，图S3），对照小鼠LCZ预防组和治疗组的3种肠道物种（AlistiPes finegoldii、Bacteroides uniformis、Bacteroides intestinalis）显著增加（图4E，图S3）。

图4 小鼠结肠含量的微生物宏基因组分析显示，LCZ调控HFD喂养的glut1 KO小鼠和绒毛特异性glut1 KO小鼠的肠道微生物群。5个组分别为：GV（n=6）、GVP（n=5）、GF（n=6）、GFP（n=6）和GFT（n=6）。（A）门水平肠道微生物群图谱。（B） Bacteroidetes 和 Firmicutes比例。（C）加权UniFrac距离的主坐标分析显示了各组间肠道微生物宏基因组的差异。（D）Shannon多样性指数。（E）显示20个分布的热图各组/样本中存在显著差异（原文图3）。

确定不同类群中细菌物种之间的相互作用是一件有趣的事情（图5），观察到GV和GF之间有很大的重叠边缘（GV vs GF），Bacteroides intestinalis和Bacteroides acidificiens之间也存在正相关关系（GF vs GFP，GFT），表明它们在减少肥胖方面具有潜在的有益作用。在GV和GVP的相关网络中， Faecalibaculum rodentium与大多数物种呈强负相关，包括 Alistipes finegoldii、Bacteroides uniformis、Oscillibacter valericigenes、Acetatifactor muris，这表明用LCZ治疗的glut1 CKO小鼠的肥胖减少可能是通过Faecalibaculum rodentium来调节多种物种。

图5 HFD喂养的野生型小鼠与绒毛特异性glut1 KO小鼠之间肠道物种的相关网络采用Spearman相关分析。黄色实心/灰色虚线边分别表示Spearman秩相关系数为>0.5和<−0.5。边的宽度代表相关性的强度（边缘越宽，相关性越强；原文图4）。

在glut1 CKO小鼠和使用或不使用LCZ的对照组小鼠中发现了20个显著差异丰富的KEGG通路（图6A），而给HFD-glut1 CKO小鼠注射LCZ会耗尽肠道微生物组中的这20个KEGG通路（与glut1 CKO小鼠相比），这表明摄入LCZ可能会降低大量微生物酶的功能。这些KEGG通路主要与辅助因子和维生素生物合成、脂肪酸代谢、ATP合成、代谢能力和碳固定参与能量代谢有关，与未接受益生菌的glut1 fl/fl小鼠相比，给予LCZ的glut1 fl/fl小鼠微生物组中显著富集（GFP vs GF，图6A，6B）。与HFD-glut1 fl/fl小鼠相比，HFD-glut1 CKO小鼠中15个KEGG通路的基因丰度富集，表明glut1基因影响微生物酶功能，而不是与葡萄糖转运相关的影响（图6A），由于抑制宿主肠道glut1的表达，属于磷酸盐和氨基酸转运系统的糖、多元醇和脂质转运系统的KEGG通路在glut1 CKO小鼠微生物组中显著富集，因此LCZ的摄入似乎调节了这两种KEGG通路（图6C，6D）。

图6 参与益生菌介导的差异丰富的途径和基因在HFD喂养的对照组小鼠和绒毛特异性glut1 KO小鼠中发现了抗肥胖作用。（A）热图显示了差异丰富的KEGG途径，特别是与（B）脂肪酸代谢，（C）糖、多元醇和脂质运输系统，（D）磷酸盐和氨基酸转运系统相关的途径。P<0.05*；P<0.01**（原文图5）。

并对GV和GVP中的小肠菌群进行了检测和分析，小肠细菌群落组成的MDS分析显示，GV与GVP之间无显著性差异（图7A）。在小肠中，与glut1 fl/fl小鼠相比，HFD喂养的glut1 CKO小鼠中Lactobacillus reuteri的相对丰度增加，而LCZ干预使glut1 fl/fl小鼠的Enterorhabdus mucosicola富集（图7B，7C），载玻片中显示GVP小鼠回肠的粘液和绒毛更长（图7D）。

图7 LCZ调控HFD喂养的glut1 CKO小鼠的小肠菌群。GV（HFD喂养的glut1 CKO小鼠，n=6）和GVP（LCZ处理的HFD喂养的glut1 CKO小鼠，n=5）。（A）小肠菌群的MDS图。（B）和（C）Lactobacillus reuteri 和Enterorhabdus mucosicola 等小肠物种的相对丰度。P<0.05*； P<0.01**。（D）在GV组和GVP组中，苏木精和伊红染色的回肠切片代表性图像。比例尺，上面板400µm，下面板100µm（原文图6）。

讨论

本研究采用条件敲除小鼠模型，研究了肠道特异性glut1、肠道微生物群和中心性肥胖之间的关系，发现益生菌株LCZ通过有益调节肠道微生物群，显著降低了野生型小鼠和绒毛特异性glut1 KO小鼠的肥胖（特别是通过调节不同的肾周脂肪沉积）。

与LCZ类似，给予Lactobacillus plantarum HAC01可减少小鼠的肠系膜脂肪沉积，HFD可诱导肠系膜脂肪中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平升高，而肾周脂肪和附睾脂肪水平不升高，因此肠系膜脂肪被认为是炎症性脂肪，有助于增加肠道通透性、微生物群的改变和全身炎症，肾周脂肪过多可导致脂肪毒性和肾脏损伤。另一项研究发现，益生菌菌株Bacillus subtilis SJLH001可以降低肾周脂肪和pWAT肌酐水平，与减轻肾小球扩张有关，因此LCZ介导的肾周脂肪减少可能是对HFD诱导的肾脏损伤有保护作用。数据显示LCZ不仅阻止了HFD喂养小鼠肠系膜和肾周脂肪的积累，而且还减少了glut1缺陷高血糖小鼠肠系膜和肾周脂肪的沉积。因此研究在糖尿病患者中是否存在类似的降脂作用和机制是很有意义的。

glut1介导葡萄糖进入大脑，它是一种血脑屏障必需的蛋白质，促进从血液循环中吸收葡萄糖，然而肠道绒毛glut1在介导肥胖中葡萄糖转运中的作用尚不清楚。证据表明肠道通透性的增加和Ⅱ型糖尿病与肥胖密切相关，其特征是肠道微生物群的改变和炎症性。此外已知肠道通透性的增加会造成肥胖中脂肪积累和胰岛素抵抗，与glut1 fl/fl小鼠相比，glut1 CKO小鼠有更高的初始体重、快速的脂肪积累和OGTT在30min时血糖水平的急剧升高，表明肠道绒毛葡萄糖转运的损伤可能影响肠道通透性，这种影响通过调节肠道微生物群发挥作用，而肠道绒毛glut1 CKO小鼠的肠道微生物群组成与glut1 fl/fl小鼠有很大的不同。

肠道微生物群在人类和动物的能量获取与肥胖中都起着致病作用，其改变影响肠道通透性，从而诱导产生慢性炎症。研究观察到HFD喂养的glut1 CKO小鼠和HFD喂养的glut1 fl/fl小鼠肠道微生物组存在显著差异。先前的研究发现，炎症小体缺乏小鼠中Barnesiella intestinihominis多于对照组小鼠，且与肝脏脂肪变性加重相关。此外在用空腹诱导的高血糖小鼠粪便移植的小鼠中，B. intestinihominis是导致HFD诱导的脂肪性肝炎的关键肠道微生物，在glut1 CKO小鼠中，B. intestinihominis与WAT快速增加之间存在相关性，而LCZ干预降低了肠道B. intestinihominis的相对丰度，从而降低了glut1 CKO小鼠中mWAT和pWAT的重量。Faecalibaculum rodentium是glut1 CKO小鼠中的另一种富集微生物，虽然是SCFA产生者并且能发挥抗癌作用，但微生物的SCFAs可能为宿主提供额外的能量促进肥胖。

肠道中低比例的Firmicutes/Bacteroidetes通常被认为是人类和动物肥胖的生物标志物，益生菌LCZ干预增加了HFD喂养的glut1 CKO小鼠和glut1 fl/fl小鼠的肠道中Firmicutes/Bacteroidetes的比例，表明LCZ可以缓解HFD诱导的门水平肠道微生物群的不良变化。Bacteroides intestinalis 和Bacteroides acidificiens主要通过LCZ干预HFD喂养的glut1 fl/fl小鼠富集，而LCZ促进HFD喂养的glut1 CKO小鼠的 Bacteroides uniformis 和Bacteroides rodentium。先前的研究发现，Bacteroides uniformis可以减缓HFD喂养的小鼠体重上升，增加小的脂肪细胞数量，并降低血脂浓度。Bacteroides acidificiens也被证明是减少Atg7缺陷小鼠脂肪数量的关键微生物。之前研究表明，在肥胖受试者中Bacteroides intestinalis的相对丰度减少了3.5倍以上，并与炎症标志物呈负相关，另一种拟杆菌属Bacteroides rodentium发现在HFD喂养的大鼠中显著减少。

Alistipes finegoldii可吸收肠道环境中的中链脂肪酸和长链脂肪酸，使脂质还原，LCZ干预提高了glut1 fl/fl小鼠的肠道Alistipes finegoldii水平和脂肪酸代谢相关基因的丰度。最近的一些研究从接受高热量饮食的肥胖小鼠中分离出了Acetatifactor muris，因此它被认为是一种导致DSS诱导的小鼠结肠炎的炎症微生物。Odoribacter被认为是有益的细菌，因为它们与非酒精性脂肪肝和炎症性肠病的严重程度呈负相关，该物种Odoribacter splanchnicus可产生SCFAs，并具有抗炎活性。此外，LCZ还提高了HFD喂养的glut1 CKO小鼠小肠中Enterorhabdus mucosicola 丰度，降低了Lactobacillus reuteri丰度，Enterorhabdus mucosicola伴有粘膜表面和粘蛋白降解能力，已被报道为瘦小鼠动物微生物群。在HFD喂养的小鼠中富集的特异性Lactobacillus reuteri可能具有通过Peyer's补丁诱导促炎细胞因子的能力。

KEGG通路分析的结果表明LCZ通过一个矛盾的作用来平衡能量代谢。一方面，在HFD-glut1 fl/fl小鼠的生物合成基因和代谢相关途径中存在富集。另一方面，LCZ在HFD-glut1 CKO小鼠中同时显著减少了许多通路，包括一些生物合成基因和代谢相关通路。这些结果证实了LCZ作为一种益生菌在其抗肥胖作用中的特定功能。

综上所述，本研究证实LCZ对HFD喂养的野生型和绒毛特异性glut1 KO小鼠均有抗肥胖作用，并且这种作用减少了体重和体脂的储存。但这项研究有几个局限性，最重要的限制是两个绒毛特异性glut1 KO小鼠组的小鼠数量非常少，因为很难确保有足够的绒毛特异性glut1 KO小鼠与对照组glut1小鼠同一时间出生。另一个限制是代谢物测定的损失，如短链脂肪酸和胆汁酸谱。在未来的研究中，需要进行代谢组学分析和肠道通透性及炎症评估。

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