发酵工程制药(Fermentation

1、发酵工程发酵工程（Fermentation Engineering）第一节第一节 概概 述述发酵的相关概念发酵的相关概念 发酵工程的发展简史发酵工程的发展简史 发酵类型发酵类型微生物发酵生产的药物微生物发酵生产的药物一、发酵的相关概念一、发酵的相关概念 发酵发酵：传统发酵：传统发酵 生化和生理学意义的发酵生化和生理学意义的发酵 工业上的发酵工业上的发酵 传统发酵传统发酵：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或：最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。生化和生理学意义的发酵生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件

2、下，：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出并放出CO2。工业上的发酵工业上的发酵：泛指利用微生物制造或生产某些产品：泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程的过程 包括：厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等；包括：厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等；通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨

3、基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。酶等。发酵工程发酵工程：利用微生物的特定性状，通过现代：利用微生物的特定性状，通过现代工程技术在生物反应器中生产有用物质的一种技工程技术在生物反应器中生产有用物质的一种技术体系。术体系。二、发酵工程的发展简史二、发酵工程的发展简史19世纪或更早世纪或更早:酿酒、酒变质酿酒、酒变质20世纪初：一战世纪初：一战-丙酮丁醇的发酵丙酮丁醇的发酵1929年年1942：青霉素的发现及生产：青霉素的发现及生产20 世纪世纪40 年代：抗生素工业年代：抗生素工业 20 世纪世纪50 年代：氨基酸发酵工业年代

4、：氨基酸发酵工业 20世纪世纪60年代：酶制剂工业年代：酶制剂工业70年代年代：非碳水化合物代替碳水化合物的发酵：非碳水化合物代替碳水化合物的发酵 80 年代以来：重组年代以来：重组DNA 技术技术第一个第一个 大规大规模工业生产的模工业生产的发酵过程发酵过程厌氧发酵厌氧发酵 有氧发酵有氧发酵三、发酵类型及微生物发酵生产的药物三、发酵类型及微生物发酵生产的药物1.微生物菌体发酵微生物菌体发酵 2.微生物的酶微生物的酶 3.微生物代谢产物发酵微生物代谢产物发酵 4.微生物转化发酵微生物转化发酵 5.微生物特殊机能的利用微生物特殊机能的利用 1、微生物菌体发酵、微生物菌体发酵定义：是以获得具有多种

5、用途的微生物菌体细胞定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。定期产量最高。2、微生物的酶、微生物的酶 酶的特点：易于工业化生产，便于改善工酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。艺提高产量。分

6、类：胞内酶分类：胞内酶 和胞外酶和胞外酶生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。3、微生物代谢产物发酵、微生物代谢产物发酵 包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢各种次级

7、代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。中间代谢产物和初级代谢产物。4、微生物转化发酵、微生物转化发酵 定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。似但具有更在经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。某一特定部位进行化学反应而形成的。微生物发酵生产的药物：微生物发酵生产的药物：

8、主要包括：主要包括：抗生素类抗生素类、氨基酸类氨基酸类、核核苷酸类苷酸类、维生素类维生素类、甾体类激素甾体类激素、治治疗酶及酶抑制剂疗酶及酶抑制剂5、微生物特殊机能的利用、微生物特殊机能的利用 利用微生物消除环境污染利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保持生态平衡利用微生物发酵保持生态平衡微生物湿法冶金微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。发酵的流程：发酵的流程：空气空气空气净化处理空气净化处理保藏菌种保藏菌种斜面活化斜面活化扩大培养扩大培养种子罐种子罐主发酵主发酵碳源、氮源、碳源、氮源、无机盐等营养无机盐等营养物质物质灭菌灭菌产物分离纯化产物分

9、离纯化成品成品菌种选育菌种选育第二节第二节 发酵过程中的微生物发酵过程中的微生物 微生物：指形体微小微生物：指形体微小(小于小于0.1mm)，结构简单，在，结构简单，在适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显微镜才能看清楚的生物。目前已经知道的微生物约有微镜才能看清楚的生物。目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中：万种，分布在以下各界中：原核生物界原核生物界：例如细菌、放线菌、蓝藻：例如细菌、放线菌、蓝藻真菌界真菌界：例如酵母菌、霉菌、大型真菌：例如酵母菌、霉菌、大型真菌原生生物界原生生物界：例如草履虫、变形虫、衣藻：例如草履虫、

10、变形虫、衣藻病毒病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、噬菌体：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒、噬菌体一、常见的药用微生物一、常见的药用微生物1、细菌、细菌 细菌的形态：球形、杆形、螺旋形细菌的形态：球形、杆形、螺旋形螺旋菌螺旋菌球菌球菌杆菌杆菌细菌的繁殖细菌的繁殖：细菌的结构细菌的结构：特殊的结构：特殊的结构：荚膜、鞭毛、芽孢荚膜、鞭毛、芽孢荚膜荚膜 主要成分为多糖，与其致病性有关。主要成分为多糖，与其致病性有关。芽孢芽孢 细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆 性很强的性很强的休眠体休眠体,以度过不良的环境。以度过不良的环境。一般说，芽孢不起繁一般说，芽孢不起繁殖作用，

11、只起度过不良殖作用，只起度过不良环境的作用，芽孢对热、环境的作用，芽孢对热、紫外线和许多有毒化学紫外线和许多有毒化学物质有很强的抗性物质有很强的抗性细菌的代谢类型：细菌的代谢类型：自养自养：硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。：硝化细菌、铁细菌、硫细菌等。异养异养：大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。：大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌等。腐生腐生依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯草杆菌，它落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯草杆菌，它可以引起食物的腐败。可以引起食物的腐败。寄生寄生从活的动植物体内吸取有机物来生活。例如从活的动植物体内吸

12、取有机物来生活。例如寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾需氧型需氧型：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根细菌、根 瘤菌等。瘤菌等。厌氧型厌氧型：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，产甲烷杆菌，：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，产甲烷杆菌，乳酸菌等。乳酸菌等。细菌的代谢类型与在生态系统中处于的地位细菌的代谢类型与在生态系统中处于的地位?异养需氧型异养需氧型异养厌氧型异养厌氧型自养需氧型自养需氧型自养厌氧型自养厌氧型分解者或消费者分解者或消费者生产者生产者细菌的菌落：细菌的菌落：单个或者少数细菌在固体培养基

13、上大量单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。形态结构的子细胞群体。2、放线菌、放线菌介于细菌和真菌之间的一类微生物介于细菌和真菌之间的一类微生物放线菌的形态放线菌的形态：放线菌的结构放线菌的结构 常见放线菌：常见放线菌：连霉菌属连霉菌属 链霉素、金霉素、四环素链霉素、金霉素、四环素诺卡氏菌属诺卡氏菌属 利福霉素利福霉素小单孢菌属小单孢菌属 庆大霉素庆大霉素游动放线菌属游动放线菌属 创新霉素创新霉素产生抗生素最多产生抗生素最多的一类微生物的一类微生物3、真菌、真菌 伞菌类。属于真核生物，但不含叶绿素，伞

14、菌类。属于真核生物，但不含叶绿素，无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成，按无根、茎、叶，由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式繁殖。在自然界分布广泛，有性或无性方式繁殖。在自然界分布广泛，以寄生或腐生方式存在。以寄生或腐生方式存在。代谢产物代谢产物：抗生素（青、头孢、灰黄）、维生素、：抗生素（青、头孢、灰黄）、维生素、酶制剂、各种有机酸、葡萄糖酸、麦角碱酶制剂、各种有机酸、葡萄糖酸、麦角碱直接入药直接入药：冬虫夏草、麦角、神曲、僵蚕、灵芝：冬虫夏草、麦角、神曲、僵蚕、灵芝等等常见真菌：常见真菌：藻状菌纲：根霉藻状菌纲：根霉-生产甾体激素、延胡索素生产甾体激素、延胡索素及酶制剂及酶制剂子囊子囊菌纲

15、菌纲：酵母菌属：酵母菌属担子菌纲：灵芝担子菌纲：灵芝半知菌纲半知菌纲:曲霉属、青霉属、头孢菌属曲霉属、青霉属、头孢菌属4、病毒、病毒 化学组成化学组成形态单位形态单位功能功能排列方式排列方式由蛋白质构成由蛋白质构成衣壳粒衣壳粒通常由通常由1-6个多个多肽分子组成肽分子组成保护核酸保护核酸决定抗原特异性决定抗原特异性使病毒呈现不同的形态使病毒呈现不同的形态衣壳衣壳病毒的繁殖病毒的繁殖二、生产菌种的选育二、生产菌种的选育自然选育自然选育自然突变与定向培养自然突变与定向培养诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种原生质体融合原生质体融合基因重组基因重组 自然选育自然选育 以采集土壤为主。一般园田土和耕作以采

16、集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。些水域等。采集对象：采集对象：菌种保存：菌种保存：1.斜面低温保藏法斜面低温保藏法2.石蜡油封存法石蜡油封存法3.砂土管保藏法砂土管保藏法4.曲法保藏法曲法保藏法5.甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法6.冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法7.液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法8.

17、宿主保藏法宿主保藏法第三节第三节 发酵设备与消毒灭菌发酵设备与消毒灭菌发酵设备：种子罐、发酵罐发酵设备：种子罐、发酵罐发酵罐：生物反应器发酵罐：生物反应器需氧微生物反应器（通气发酵罐）需氧微生物反应器（通气发酵罐）厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）厌氧微生物反应器（嫌气发酵罐）尽量减少杂菌和噬菌体污染是微生物反应器所尽量减少杂菌和噬菌体污染是微生物反应器所必须具备的第一个条件。反应器内壁和管道焊接的必须具备的第一个条件。反应器内壁和管道焊接的部分，要求平滑、无裂缝和塌陷。此外，阀门应保部分，要求平滑、无裂缝和塌陷。此外，阀门应保持清洁。所有阀门和接管处必须用蒸汽灭菌。容器持清洁。所有阀门和接管处必

18、须用蒸汽灭菌。容器主体的结构要简单、容易清洗。当反应器受到的外主体的结构要简单、容易清洗。当反应器受到的外压略大于内压时，要防止液体和空气从反应器外流压略大于内压时，要防止液体和空气从反应器外流入器内。入器内。大部分微生物反应器都是针对微生物悬浮在培大部分微生物反应器都是针对微生物悬浮在培养基中的，统称为深层发酵罐的形式。养基中的，统称为深层发酵罐的形式。主要内容主要内容（一）培养基及灭菌（一）培养基及灭菌1.培养基的定义、成份培养基的定义、成份2.培养基的类型培养基的类型3.培养条件培养条件4.培养基确定方法培养基确定方法5.培养基的灭菌：空消、实消、连消培养基的灭菌：空消、实消、连消（二）

19、发酵工程制药的过程与控制（二）发酵工程制药的过程与控制1.种子的扩大培养种子的扩大培养定义、目的定义、目的优良的种子应具备条件优良的种子应具备条件几个与种子有关的参数：发酵级数、种龄、接种几个与种子有关的参数：发酵级数、种龄、接种量量2.微生物发酵方式微生物发酵方式（三）思考题练习（三）思考题练习一、培养基及灭菌一、培养基及灭菌（一）、（一）、培养基的定义、成份培养基的定义、成份 培养基（培养基（culture mediumculture medium）：是人工）：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。谢产物的营养基质。主要成分：主要成分：

20、碳源、氮源、无机盐、生碳源、氮源、无机盐、生长因子、前体、水长因子、前体、水1、碳源、碳源 作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的的能源能源和合成菌体所必需的和合成菌体所必需的碳成分碳成分来源来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃糖类、油脂、有机酸、正烷烃工业上常用的糖类：葡萄糖、蜜糖工业上常用的糖类：葡萄糖、蜜糖2、氮类、氮类 作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质作用：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。机氮源。（1）

21、无机氮源：）无机氮源：常用：硫酸铵、硝酸钠常用：硫酸铵、硝酸钠特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起引起pH的变化如：的变化如：(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质生理酸

22、性物质，如硫酸胺，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生生理碱性物质理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pH（2）有机氮源）有机氮源来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄原料，花生饼粉、黄豆饼粉豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆

23、、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、玉米蛋白粉、牛肉膏牛肉膏、蛋白胨蛋白胨、酵母粉酵母粉、鱼粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子供大量的无机盐及生长因子例例 玉米浆玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸素）、苯乙酸 较多的乳酸硫、磷、微量元较多的乳酸硫、磷、微量元素等素等工业常工业常用用实验室实验室常用常用3、无机盐的微量元素、无机盐的微量元素1、作用：各种不一样、作用：各种不一样2、来源：来源：C、N源，以盐的形式补充源，以盐

24、的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（、使用时注意盐的形式（pH的变化）的变化）例例：黑曲酶黑曲酶NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，P对酶活的影响对酶活的影响 pH 酶活酶活不加不加 4.25 120

25、分钟分钟加加 K2HPO4 5.45 30分钟分钟加加 KH2PO4 4.62 75分钟分钟4、生长因子、前体和产物促进剂、生长因子、前体和产物促进剂（1）生长因子：）生长因子：通常指那些微生物生长所必需而通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或且需要量很小，但微生物自身不能合成或 合成合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。量不足以满足机体生长需要的有机化合物。广义广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子称为生长因子(又称生长素又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；嘧啶、维生素

26、等；狭义狭义说，生长素仅指维生素。说，生长素仅指维生素。与微生物有关的维生素主要是与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。们，酶就不能活动。凡是缺少合成生长素类物质的微生物凡是缺少合成生长素类物质的微生物(即缺少即缺少了合成生长素过程中的某种酶了合成生长素过程中的某种酶)，统称为营养缺陷，统称为营养缺陷型。型。前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到物在生物合成过程中合成到产物产物物分子中去，而其自身的

27、结物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。的提高。（2）前体）前体青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量136作用作用：前体有助于提高产量和组份：前体有助于提高产量和组份 P107用量用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题率的问题例：例：6000单位单位/ml的青霉素的青霉素G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸 青霉素青霉素6000*0.6（微克）（微克）36mg/ml 苯乙酸（苯乙酸（36*136）/356=13

28、.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在实际使用时的转化率在46-90%之间之间 例某厂单耗为：例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）亿青霉素）转化率为：转化率为：13.8/(0.337/0.6)*36=68%用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率流加也有利于提高前提的转化率（

29、3）产物促进剂）产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂

30、对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。（5）水）水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致

31、清洁的对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。水。（二）培养基的类型（二）培养基的类型液体用 途化学成分物理性质作 用类 型分类依据半固体固体合成天然孢子培养基种子培养基发酵培养基 工业生产 观察微生物的运动、鉴定菌种的分离、计数分类、鉴定工业生产供菌种繁殖孢子提供大量优质的菌体累积代谢产物固体培养基固体培养基半固体培养基半固体培养基液体培养基液体培养基基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基选择培养基选择培养基：在培养基内加入某种化学物质或：在培养基内加入某种化学物质或去除某些营养物质以抑制杂菌。去除某些营养物质以抑制杂菌。加富培养基加富培养基：在培养基中加入特定的营养物质，：

32、在培养基中加入特定的营养物质，以供少数特殊需要的微生物生长的培养基。以供少数特殊需要的微生物生长的培养基。富集培养富集培养：在培养基中加入特别的营养要素以：在培养基中加入特别的营养要素以增殖少数微生物的培养方式。增殖少数微生物的培养方式。发酵培养基的要求：发酵培养基的要求：培养基能够满足产物最经济的合成。培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的大规模储藏，能保证生产上

33、的 供应。供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。等。合成培养基合成培养基 :原料其化学成分明确、稳定原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产于大规模工业生产 天然培养基天然培养基：采用天然原料：采用天然原料 原料来源丰富原料来源丰富(大多为农副产品大多为农副产品)、价格低廉、价格低廉、适于工业适于工业 化生产；原料质量等

34、方面不加控制化生产；原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性会影响生产稳定性 培养大肠杆菌常用两种培养基培养大肠杆菌常用两种培养基：M培养基培养基(1L)：Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，CaCl2 0.011g，葡萄糖，葡萄糖 2-10,pH 7.0 YPS培养基培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl 10g，PH 7.2 固体培养基固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌

35、类，如香菇、白也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产木耳等的生产 半固体培养基半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为量的琼脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于主要用于微生物的鉴定。微生物的鉴定。液体培养基液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性是水，其中配有可溶性的或不溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。用的培养基。（三）培养条件（三）培养条件1.温度温度 2.pH值值 3.氧氧4.种龄种龄5.接种量接种量1、温度、温度 通常在生物学范围内每升高通常在生物学范围内每升高

36、1010，生，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。生长和合成酶。机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对机体的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，总体微生物可生长的温度范围较广，总体说在说在-10-109595。2、pH值值 培养基中的培养基中的pHpH值与微生物生命活动有着密切值与微生物生命活动有着密切关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的关系，各种微生

37、物有其可以生长的和最适生长的pHpH范围。范围。微生物通过其活动也能改变环境的微生物通过其活动也能改变环境的pHpH值。值。发酵过程中，控制发酵液的发酵过程中，控制发酵液的pHpH值是控制生产的值是控制生产的指标之一，指标之一，pHpH值过高、过低都会影响微生物的生值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。长繁殖以及代谢产物的积累。控制控制pHpH值不但可以保证微生物良好的生长，而值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染且可以防止杂菌的污染 一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pHpH转移，转移，高氮源培养基倾向于向碱性高氮源培养基倾

38、向于向碱性pHpH转移，这都跟碳氮转移，这都跟碳氮比直接有关。比直接有关。微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵(分子间呼吸分子间呼吸)，兼性厌气菌则两者兼而有之。兼性厌气菌则两者兼而有之。不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。通风量的要求也不相同。通风和搅拌通风和搅拌-搅拌搅拌则能使新鲜氧气更好则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且地与

39、培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。助于搅拌，使其效果更好。3、氧、氧4、种龄与接种量、种龄与接种量 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。产量。接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接接种量的大小直接影响发酵周期。大量地接入培养成熟的菌种的优点：入培养成熟的菌种的优点：1.1.

40、可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率，周期，提高了设备利用率，2.2.节约了发酵培养的动力消耗，节约了发酵培养的动力消耗，3.3.并有利于减少染菌机会并有利于减少染菌机会 一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发一般都将菌种扩大培养，进行两级发酵或三级发酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。酵。接种量和培养物的生长过程的延缓期长短呈反比。接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地接种量过多也无必要。因培养种子费时，而且过多地移人代谢废物，反而会影响正常发酵。移人代谢废物，反而会影响正常发酵。（四）培养基确定方法（

41、四）培养基确定方法（1 1）首先必须做好调查研究工作，了解菌）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。（2 2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质

42、、分子结构、的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数以便在选择培养基时做到心中有数（3 3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验基础，开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。的能力。注意培养过程中的注意培养过程中的pHpH变化，观察适合于菌种生长变化，观

43、察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pHpH，不断，不断调整配比来适应上述各种情况。调整配比来适应上述各种情况。（4 4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培

44、养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内养基内pHpH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。硫酸铵也可用来调节。（5 5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。类物质，引导发酵走向合成产物的途径。（6 6）根据生产和科学研究的需要选择培养

45、基）根据生产和科学研究的需要选择培养基(7)(7)根据经济效益选择培并基原料根据经济效益选择培并基原料（五）培养基的灭菌（五）培养基的灭菌主要湿热灭菌主要湿热灭菌空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）实罐灭菌（实消）实罐灭菌（实消）连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）二、发酵工程制药的过程与控制二、发酵工程制药的过程与控制一、菌种的扩大与培养一、菌种的扩大与培养 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养培养,最

46、终获得一定数量和质量的纯种过程。最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养的概念种子扩大培养的概念:种子扩培的目的种子扩培的目的q 接种量的需要接种量的需要q 菌种的驯化菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：q 总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求q 生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体q 无杂菌污染无杂菌污染q 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，能够迅速生长种子制备的过程种子制备的过程实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实不用

47、种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。阶段。几个与种子有关的参数：几个与种子有关的参数：发酵级数发酵级数种龄种龄接种量接种量 种子制备过程举例种子制备过程举例一、谷氨酸生产的种子制备一、谷氨

48、酸生产的种子制备制备过程制备过程斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵发酵1、斜面、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏，牛肉膏1%，氯化钠，氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2%，pH 7.0-7.2培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：培养条件：32，生长，生长18-24小时小时生长斜面要求：生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次次2.一级一级种子（摇瓶）种子（摇瓶）培养条件：于培养条件：于1000ml三角瓶中，装液三角瓶中，装液200

49、-250ml,32培培 养养12小时。小时。培养基：葡萄糖培养基：葡萄糖2%，尿素，尿素0.5%，玉米浆，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%培养基特点：培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基本接近于发酵培养基3.二级种子二级种子(种子罐种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），），32培养培养7-10个小时个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为浓度为2.5%培养基的特点培养基的特点：长菌体，

50、更接近于发酵培养基：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：种子的质量要求：108-109个个/ml大小均匀，呈单个或八字排列大小均匀，呈单个或八字排列PH 7.0-7.2时结束，时结束，6.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛二、青霉素生产的种子制备二、青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵1、斜面孢子、斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天,注意湿度注意湿度50%左

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