客户文献解读

热烈祝贺河北科技师范学院 陈教授及其团队研究成果荣登Environmental Science Nano（IF=7.7，中科院1区）

题目：Metabonomics-assisted label-free quantitative proteomic and transcriptomic analysis reveals novel insights into the antifungal effect of graphene oxide for controlling Fusarium graminearum

期刊：Environmental Science Nano

影响因子：7.7

研究背景

       真菌病原体禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，FG）是镰刀菌枯萎病（ Fusarium head blight，FHB）的病原体，镰刀菌是一种影响小麦和其他谷物（例如玉米）生产的全球性严重植物病。FG不仅造成作物产量和品质的重大损失，而且还会产生霉菌毒素，几乎破坏了受感染田间生产的所有谷物。传统上，最有效的方法是使用杀真菌剂（如多菌灵）进行化学控制，但是，农业中长期过度使用化学药品已经引起了许多严重的问题，包括增加的真菌抗性，化学残留物以及对环境和健康的危害。真菌对某些传统杀真菌剂产生的抗性使控制真菌的生长更加困难，鉴于当前控制措施的局限性以及FHB 对重要经济作物的严重影响，开发有效控制这些疾病的替代剂已迫在眉睫。

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）作为一种新型的抗植物病原体的抗菌剂开始被研究，并且被认为在农业科学中具有巨大的发展前景。之前已有文章对GO的抗菌作用进行了研究，然而对于GO的抗真菌模式仍然未知。

       为了探究GO的抗菌机制，作者利用转录组，蛋白质组学和代谢组学技术，系统地研究了GO对重要的植物病原真菌禾谷镰孢（FG）菌株PH-1的抗真菌活性，探讨其抗菌机制，以便更好的利用G0服务农业生产和改善环境。

实验思路

实验结果

1.  GO处理可以减少FG菌株PH-1的分支和生物量

       用GO处理FG菌株PH-1，通过对菌丝分支和生物量的统计，发现随着GO浓度的增加，菌丝分支和菌丝体生物量都有明显的减少，说明GO影响菌株的生长和发育。

图1 菌丝分支/生物量随GO浓度变化

2. 菌丝体在GO处理后丧失了细胞膜结构的完整性

       作者利用SEM和TEM观察菌丝体对GO处理的超微结构变化。根据SEM图像观察到对照中的菌丝体保持了其膜结构的完整性，大多数菌丝体在GO处理后丧失了其细胞完整性，并变得伸长或扁平化。同时TEM图像显示，GO处理后，菌丝体细胞壁的电子密度降低，细胞壁分层不明显。此外，GO处理的菌丝体细胞中有更多的大隔室；还可以看出GO处理后菌丝中存在许多液泡，并且可以观察到膜融合的现象，这可能是由于GO处理引起的细胞膜通透性的变化。先前的研究表明，由于石墨烯与脂质分子之间的强相互作用，GO可以从大肠杆菌膜中破坏性提取磷脂。由此，可以推测GO可以帮助从菌丝体中破坏性提取磷脂并影响膜通透性，从而导致胞质外渗，继而在处理过的菌丝中形成较大的隔室。

图2 GO处理后的SEM 与TEM 图像信息

3. 定量RT-PCR揭示GO浓度对菌株的影响

       作者进一步检测了与菌丝体发育和分支相关的几个基因的表达水平，并且进行应激相关基因的表达检测。通过改变GO浓度，检测了septins，Pods，MAP激酶和Myo2等与菌丝体的发育和分支密切相关的基因，发现随着GO浓度的升高，这些基因的表达量明显降低；与应激相关的基因uspA1，uspA2和Sim表达量随浓度的升高有明显的升高；抑制细胞增殖的基因RAS2，随着GO浓度增加表达量也逐步增加。诸如此类，这些基因表达量的变化均表明GO处理能降低菌株细胞活力，减少菌株菌丝体的分支和生物量。

图3 RT-PCR检测相关基因表达

4. 蛋白质组学要说的故事

a) 通过Label-free无标记定量蛋白质组学，作者发现不同GO浓度处理，从根本上改变了菌株的基因本体条目，使菌株体蛋白表达水平发生了大的变化。其中，与细胞、代谢过程、细胞结构相关、催化活性、细胞过程等相关的蛋白质，以及应激蛋白和膜封闭蛋白的变化较为明显。

b) 通过对差异蛋白的分析聚类，作者发现这些蛋白质主要参与能量、糖、氨基酸和N-聚糖的生物合成、脂肪酸代谢等途径。这些结果表明GO处理影响离子通道以及核苷酸和脂质代谢蛋白，这与菌丝体脱水，DNA和RNA含量降低以及细胞壁合成密切相关。这一发现与表型结果一致。

c) 此外，作者进一步分析这些差异蛋白，发现部分差异蛋白的变化对维持菌株的生命活性起着重要的作用。即为了在不同浓度的GO处理下存活，FG菌株PH-1可能会降低蛋白质表达以及某些不必要的生理和生化反应，这一现象值得进一步研究。

d) 差异蛋白 KEGG富集分析结果表明，GO处理导致FG菌株PH-1中与组氨酸代谢有关的蛋白质蓄积，这可能是GO在FG菌株PH-1上的抗真菌反应之一，而对组织特异性模块中蛋白质的COG分析表明，参与脂质合成的蛋白质减少可能是GO对FG菌株PH-1的另一种抗真菌反应。

图4  对照组与GO处理菌株FG株pH-1的蛋白质组学比较分析

图5 不同浓度氧化石墨烯处理的FG株PH-1蛋白表达层次聚类分析

图6  COG分析

5. 代谢组学分析 

       最后作者从代谢组学分析结果中发现，GO处理后海藻糖含量增加，而海藻糖被认为是真菌的主要碳源，并且是发芽初期真菌中的重要抗应激物质，表明海藻糖可当作禾谷镰刀菌响应GO处理的一种生物标志物。GO处理后组氨酸的含量增加，也表明FG遭受GO诱导的应激。此外，作为真菌细胞壁的重要成分，脂质在GO处理后含量显着下降。这可能会导致细胞壁成分减少，从而导致细胞壁不健康。 这与作者的SEM和TEM观察结果一致。

图7代谢组学分析

       在这项工作中，作者研究了GO在基因、蛋白质组和代谢水平三个层面上抑制FG菌株PH-1的生长和分支的分子抗真菌机制。在基因水平上，基因的异常表达会抑制菌丝体的分支和成熟，从而降低菌丝体的生物量；在代谢水平上， GO处理能引起代谢途径和组氨酸代谢的富集，推测组氨酸代谢可能是GO在蛋白质水平上的抗真菌反应之一，是应激反应的生物标志物；在蛋白水平上，参与细胞壁合成的脂质蛋白的数量在蛋白质水平上降低，影响菌丝体细胞壁合成。通过本次工作，作者提出GO对FG菌株PH-1的抗真菌活性可能是由于该菌株在转录、蛋白质和代谢水平上与GO的协同反应，并且这种潜在的抗真菌机制也可能通过使用GO来有效控制其他真菌。未来的研究可以在生物测定中加入其他重要的植物病原菌，扩大氧化石墨烯的抗真菌活性谱。此外，将现有的杀菌剂与氧化石墨烯相结合，研制出具有不同作用模式的新型氧化石墨烯杀菌剂，这可能是控制作物中植物病原体的另一种有效途径。

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