专访朱健康、高彩霞：用碱基编辑创造更好的作物，还能让水果更美味更健康

有什么比一个拥有完美甜度的草莓更好的了呢？然而，很多市售浆果看起来很美味，但实际味道就不一定了。

中科院遗传与发育生物学研究所高彩霞和她的团队正在解决这个问题，他们正通过简单的基因修饰来调控草莓的甜度。

“我们可以将每克草莓的总含糖量从20毫克提升到41毫克”，高彩霞说道，“而且可以设置多个梯度层次，你可以选择自己喜欢的甜度”。

包括高彩霞实验室在内，越来越多的研究团队开始采用碱基编辑（Base Editing）和先导编辑（Prime Editing）技术来提高商业谷物、水果、蔬菜的产量、抗性及对消费者的吸引力。碱基编辑和先导编辑是对广泛应用的 CRISPR-Cas9 基因编辑系统的改进，可以在特定的 DNA 位点引入精确的变化。

高彩霞研究员（右）在查看温室中的基因编辑番茄，图片来源：Stefen Chow

此前，生物医学研究人员已经在应用这些基因编辑技术来研究和治疗人类遗传疾病。而这些技术同样能够用来创造抗病性更强、营养更丰富、产量更高的作物。

更重要的是，这些基因编辑技术有望提供一种极具吸引力的方案，以替代那些需要添加其他物种基因来构建的转基因作物，转基因作物不仅面临着严格的监管审查，还面临着公众的怀疑与担忧。

著名植物生物学家、南方科技大学前沿生物技术研究院负责人朱健康院士近日在访谈中向《生物世界》表示：基因编辑技术可以精确、快速且简单地生成作物改良所需的所需基因突变，从而帮助培育出产量更高、更有营养、更耐受极端天气、需要更少化肥和农药的作物。更关键的是，基因编辑工具本质上是一种在植物中产生基因突变的生物诱变剂，很像常规诱变育种中使用的化学诱变剂和辐射。通过基因分离将基因编辑工具从被编辑的植物中去除后，就可以获得无转基因的基因编辑作物。无转基因的基因编辑作物与传统作物没有什么不同，因为它们都含有自然发生的突变，因此与传统诱变育种的作物相比，它们不会带来任何额外的食品安全或环境风险。

朱健康院士

照目前的情况来看，第一波使用碱基编辑技术的水果、蔬菜和谷物将未来几年里陆续摆上消费者的餐桌。

碱基编辑

在 CRISPR-Cas9 基因编辑中，在向导 RNA（gRNA）的引导下，Cas9酶到达基因组中特定 DNA 位点，并切断 DNA 双链。然后细胞启动非同源末端连接（NHEJ）的修复机制，这种修复机制通常会在切割位点随机插入或删除碱基对，从而破坏目标基因功能。

然而，CRISPR-Cas9 基因编辑虽然高效，但并不精准。在敲除一个基因的同时，还会产生很多你不想要的结果。如果是想优化基因的功能，而不是简单的抑制或敲除它们，那么 CRISPR-Cas9 这种缺乏可预测性的基因编辑技术就不那么可行了。

2016年，哈佛大学刘如谦（David Liu）团队找到了一种新的的解决方案——碱基编辑（Base Editing），他们将修饰过的DNA双链切割活性丧失的 Cas9 酶与胞苷脱氨酶融合，从而实现将 C-G 碱基对转化为 T-A 碱基对，即胞嘧啶碱基编辑器。次年，刘如谦团队开发出了可将 A-T 碱基对转换为 C-G 碱基对的腺嘌呤碱基编辑器。如今，已经产生了数十种碱基编辑器，能够实现从哺乳动物、植物到人类的高效、特异性碱基编辑。

2019年，高彩霞团队在 Nature Plants 发表论文，通过对乙酰乳酸合酶和乙酰辅酶 A 羧化酶基因进行碱基编辑，生成了对多种除草剂具有抗性的无转基因小麦。

此外，碱基编辑技术还能用来进行“定向进化”，将随机突变引入各种基因，以确定改善特定植物性状的新变体。

高彩霞团队2020年发表在 Nature Biotechnology 的论文就做了这样的工作。乙酰辅酶 A 羧化酶是植物代谢过程中催化植物脂肪酸合成的关键酶，是重要的除草剂靶基因。“我们组合使用了胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器，希望找到抵抗乙酰辅酶 A 羧化酶抑制剂除草剂抗性的突变”，高彩霞说道，“我们设计了200个 gRNA 以全面覆盖目标域的400个氨基酸，然后通过喷洒除草剂来筛选这些突变体，看看哪些突变体能够存活下来。”

先导编辑

尽管功能强大，但碱基编辑（Base Editing）的潜力有限。在12种碱基对转换中，碱基编辑只能可靠地实现其中4种。例如，对 C to G 的碱基转换，效率就比较低。

此外，碱基编辑不适合用来对基因进行大量修改，比如长片段的插入、替换和删除。我们可以通过 CRISPR-Cas9 实现这些类型的基因修改，但实际上效率也不高，最好的情况下，也只有大约5%的效率。

2019年，刘如谦团队开发了一种名为先导编辑（Prime Editing）的基因编辑技术，无需依赖DNA模板便可有效实现4种碱基之间的12种自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除。Nature 杂志评论这一技术是“超精确的新型基因编辑工具”， Science 杂志评论它是“超越CRISPR”的重大突破。

先导编辑使用经过修饰的 Cas9 酶（nCas9），只进行 DNA 单链切割，修饰的 Cas9 酶与逆转录酶（RT）融合，还使用了专门设计的向导 RNA pegRNA，它不仅可以将编辑器靶向基因组中的特定位点，还包含了 RNA 模板序列和引物结合序列。在 DNA 被切割后，引物结合序列与切割位点的 DNA 发生杂交，逆转录酶将 RNA 模板逆转录为 DNA，从而将所需序列写入基因组特定位点。这种方法不仅可以实现碱基的任意转换，还可以插入或删除 DNA 片段。

2022年，高彩霞团队在 Nature Biotechnology 发表论文，他们对 nCas9- RT 融合蛋白进行改造，开发出了新的工程化植物先导编辑器（ePPE），能够大幅提高对植物的基因编辑效率，且没有观察到副产物或脱靶编辑的显著增加。使用 ePPE ，高彩霞团队成功构建了对两种除草剂（甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆）具备抗性的水稻新材料。

高彩霞团队目前通过改进 pegRNA 和 nCas9-RT 复合物，构建了多种更高效率的先导编辑器，但高彩霞表示：先导编辑仍有改进的空间。

转化难题

对于一些已经进行充分研究的作物来说，应用碱基编辑或先导编辑其实并不难。高彩霞此前在访谈中对《生物世界》表示：水稻、小麦、玉米、土豆、西红柿等作物研究的很多，已经有了成熟的转化技术，包括农杆菌介导法和基因枪法，能够相对容易地把基因片段导入到植物细胞中。但农杆菌介导法会将基因编辑组份以 质粒 DNA 的形式导致植物细胞，因此会引入外源基因，这不符合无转基因的基因编辑植物的要求，而且基因编辑组份的长期存在也可能带来不必要的脱靶风险。因此，我们主要选择基因枪法，将基因编辑组分以蛋白质和RNA的形式结合在微型金属颗粒上，然后高速轰击植物细胞，这种情况下，基因编辑组份在发挥编辑作用后会很快被降解，从而实现无转基因的基因编辑植物。

朱健康团队已经在水稻、小麦、玉米、土豆和西红柿等常见作物中成功应用了碱基编辑和先导编辑技术，但朱健康也表示，在自然界中，已发现的高等植物就有超过37万种，而目前成功转化的只有几十种。

许多植物难以转化的原因有几点，例如我们缺乏对许多植物物种的细胞分离、培养和瞬时转化的知识。此外，我们对许多植物物种的基因组和关键性状也缺乏了解。这都大大限制了基因编辑技术在这些植物中的转化。

刘如谦、张锋等人创立的基因编辑农业公司 Pairwise 正在试图解决这些问题，他们通过大规模基因组测序，已经确定了超过300个浆果物种和品种的50多种性状的遗传碱基。

超越转基因作物

美国农业部，以及中国农业农村部现在都给予了基因编辑作物更大的自由度，只要这些基因编辑作物不携带外源基因。政策的放开，不代表基因编辑作物的市场化之路就会一帆风顺，如果消费者不买账，基因编辑作物还是难以真正崛起。

如果想让人们接受基因编辑作物或食品，除了证明其安全性，还要让它们对公众产生更大的吸引力。例如通过基因编辑产生更具抗病性、抗逆性的作物。不过，另一个方向似乎更为可行：通过基因编辑产生更营养、更健康、更美味的食物。

据悉，Pairwise 的基因编辑食品正在快速推进，它们的第一个产品将是碱基编辑的营养含量更高的绿叶蔬菜，预计将于明年进入美国市场。此外，Pairwise 还在开发一款无核樱桃，目前正在进行田间测试，由于樱桃树的长成需要花费更长时间，因此无核樱桃的上市还要再等等。

朱健康院士此前也在访谈中对《生物世界》表示：基因编辑不仅可以创造产量更高、更具抗性的作物，还能让作物营养含量更高，甚至让瓜果产生更多的抗衰老物质（例如NMN），从而帮助延年益寿。

此外，基因编辑的另一种应用同样具有巨大的潜力和价值：加速野生作物的驯化。高彩霞团队就曾使用基因编辑技术操纵与果实大小、产量和营养成分相关的5个基因来驯化野生番茄。“通过自然驯化，这个过程从开始到结束需要8000年时间”，高彩霞说道，“而现在，只需要一年半了”。

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