君山银针茶提取物通过调节高脂饮食喂养大鼠的肠道菌群和代谢内毒素

　　Abstract

　　肥胖与肠道菌群失调和代谢内毒素有关。君山银针茶提取物（JSTE）可减少肥胖小鼠的脂肪堆积和体质量。然而，JSTE在预防肥胖方面的作用和机制尚不清楚。因此，使用不同剂量的JSTE（75、150和300 mg/（kg·day））来评估干预8周下对高脂饮食（HFD）诱导的大鼠的影响。结果表明，JSTE可以显著减少体质量增加，血脂水平和脂肪堆积，改善肝组织的脂肪损伤。此外，JSTE增加了HFD大鼠肠紧密连接蛋白的表达，缓解了代谢性内毒素血症和慢性低度炎症。粪便样本测序表明，JSTE可有效逆转HFD喂养大鼠的微生物多样性和厚壁菌门与拟杆菌门的比例达到正常水平。与肥胖呈正相关的Desulfovibrioceae和Erysipelotrichaceae通过JSTE干预减少。而与肥胖呈负相关的Bifidobacteriaceae、Bacteroidaceae、Akkermansia和Clostridium则有所增加。总之，这些结果表明，JSTE可能通过调节HFD诱导的大鼠肠道菌群失调、肠道屏障功能障碍、代谢性内毒素血症和慢性低度炎症来有效预防肥胖。

　　Introduction

　　肥胖被定义为可能损害健康的异常或过度脂肪堆积。甘油三酯（TG）形式的长期不平衡能量储存的摄入和消耗可能会增加脂肪组织和体质量。肥胖已成为一个严重的全球健康问题，其患病率迅速增加。据报道，到2030年，全球超过50%的人口将肥胖。近年来，随着人们饮食习惯的改变和生活水平的提高，营养过剩导致的单纯性肥胖已成为肥胖的主要类型。肥胖的发展与代谢性疾病的发生密切相关，如高脂血症、糖尿病和非酒精性脂肪肝。肥胖一旦形成就很难控制。然而，目前常用的减肥药和节食措施对身体的副作用更大，及早预防是控制肥胖的关键。

　　越来越多的研究支持这样一个事实，即高脂肪饮食引起的肥胖与代谢性内毒素血症和肠道稳态密切相关。慢性低度炎症是肥胖的关键机制，通过参与多个器官生理活动的炎症因子。此外，代谢性内毒素血症被认为是慢性低度炎症的主要原因，其特征是革兰氏阴性菌衍生的血浆脂多糖（LPS）水平显著升高。研究表明，肥胖小鼠的粪便移植改变了肠道微生物群的多样性和类型，增加了肠道通透性和代谢内毒素水平，导致慢性低度炎症和肥胖。一项线性研究表明，移植来自健康供体的肠道微生物群可在6周内改善肥胖志愿者的胰岛素抵抗和产生丁酸盐的微生物，这表明肠道微生物群可以被开发为调节人类胰岛素敏感性的新候选者。此外，肠道微生物群和肠道之间共同进化的肠道屏障形成了有效的防御，防止内毒素转移到体循环中。然而，高脂肪饮食会促进革兰氏阴性菌的数量，破坏肠道屏障并导致肠道通透性增加。大量穿透肠道的LPS结合触发代谢性内毒素血症，诱导促炎细胞因子表达，导致慢性低度炎症和肥胖。

　　茶（Camellia sinensis）是世界上最受欢迎的三种饮料之一。根据其制造工艺和发酵程度可分为6类：未发酵绿茶、微发白茶、轻发酵黄茶、半发酵乌龙茶、全发酵红茶、后发酵红茶。许多研究表明，茶对肥胖的调节与肠道微生物群之间存在复杂的关系。

　　君山银针茶是一种轻发酵茶，主要产于中国湖南省岳阳市。它是中国十大最著名的传统茶之一。已有研究表明，君山银针茶提取物（JSTE）可有效调节高脂饮食小鼠的血脂和肝脂肪变性。然而，这些研究主要集中在JSTE对肥胖的治疗效果上，目前尚不清楚JSTE预防肥胖的作用和机制。考虑到早期预防和肠道菌群对肥胖症的重要性，建立了肥胖预防模型，以评估JSTE在调节高脂饮食大鼠中的疗效和机制。

　　Results

　　JSTE对肥胖特征及食物能量利用的影响

　　干预8周后，JSTE对高脂饮食大鼠的影响如图1所示。与ND组相比，HFD组的体质量、Lee指数、肝脏重量、脂肪组织重量（附睾和肾周脂肪）、脂肪分数和食物能量利用率显著增加。然而，与HFD组相比，JSTE降低了体质量、Lee指数、肝脏重量和脂肪组织重量、脂肪系数和食物利用率。特别是，HFD-M组和HFD-H组的肥胖特征几乎逆转到与ND组相同的水平。

　　图1  补充JSTE对HFD诱导大鼠体质量增加、食物能量利用和脂肪积累的影响

　　JSTE对血脂、空腹血糖和活体形态的影响

　　JSTE对高脂饮食大鼠脂质、空腹血糖和活体形态的影响如图2所示。与ND组相比，HFD治疗大鼠血清TC、TG、LEP、ADP和空腹血糖水平显著升高。但JSTE能有效降低高脂饮食大鼠血清TC、TG、LEP、ADP和空腹血糖水平，血清胰岛素水平有一定降低但效果无显著。此外，JSTE减弱了高脂饮食喂养大鼠肝脏中TC和TG的含量，表明JSTE对肝功能具有良好的保护作用。此外，H&E和油红O染色结果显示，ND组肝组织中几乎没有脂质沉积和炎症，而HFD组则观察到大量脂质和明显的肝细胞气球。有趣的是，JSTE补充剂可以以剂量依赖性方式缓解肝脏脂质沉积和炎症。

　　图2  补充JSTE对HFD诱导大鼠脂质、空腹血糖和活形态的影响

　　JSTE对结肠形态和杯状细胞的影响

　　肠道完整性对肠道稳态有重要影响。结肠的代表性H&E和PAS染色切片如图3L所示。H&E染色结果显示，ND组结肠病理形态正常，无炎症和损伤。HFD组的结肠在黏膜和黏膜下层显示出广泛的炎症浸润和水肿。然而，JSTE减轻了HFD诱导的大鼠结肠组织病理学损伤。结肠形态学评分显示，JSTE可以剂量依赖性地减轻炎症的严重程度（图3A）。此外，HFD喂养大鼠结肠的PAS染色显示，与ND组相比，杯状细胞数量明显减少，而JSTE干预明显增加了杯状细胞密度（图3B）。

　　图3  补充JSTE对HFD诱导大鼠结肠形态、杯状细胞、炎症和紧密连接蛋白的影响

　　JSTE对肠道炎症和内毒素的影响

　　JSTE对肠道炎症的影响如图3C和D所示。八周的HFD治疗显著增加了TLR4的水平，降低了IL-10的水平。JSTE显著降低TLR4水平，增加IL-10水平。此外，还在图3E中检测到血清内毒素含量。与ND组相比，HFD干预显著提高了血清LPS水平。而JSTE以剂量依赖性方式显著降低血清LPS水平。

　　JSTE对肠紧密连接蛋白表达的影响

　　具有代表性的免疫荧光切片显示了肠紧密连接蛋白 ZO-1 和闭合蛋白的表达（图3M）。与ND组相比，长期高脂饮食导致大鼠ZO-1和闭合素的相对表达显著降低。然而，JSTE剂量依赖性地增加了高脂肪饮食大鼠中ZO-1的相对表达。此外，HFD-M和HFD-H的干预显著增加了闭塞蛋白的相对表达（图3J和K）。这些结果表明，JSTE在蛋白表达水平上促进了肠道屏障功能。

　　JSTE对血清炎性细胞因子的影响

　　与ND组相比，高脂饮食大鼠促炎因子TNF-α、IL-6和PAI-1的血清浓度显著升高，抗炎因子IL-10显著降低（图3F-I）。然而，JSTE可以有效地逆转高脂饮食诱导的血清TNF-α、IL-6和PAI-1水平升高至ND组的水平。此外，高剂量JSTE干预显著增加了高脂肪饮食大鼠抗炎因子IL-10的血清水平。

　　JSTE对肠道菌群的影响

　　为了研究JSTE对高脂饮食大鼠肠道菌群的影响，使用16S rRNA基因进行测序分析。各组样品的稀释曲线趋于平坦，表明测序深度基本覆盖了样品中所有物种，测序结果可用于后续肠道微生物多样性分析。使用Shannon和Simpson指数对肠道微生物群进行α多样性分析。HFD组的Shannon指数较ND组显著下降。虽然辛普森指数在一定程度上增加，但没有显著影响（图4A）。然而，在JSTE的干预下，各组的Shannon和Simpson指数发生了不同程度的变化。特别是，高剂量JSTE组的Simpson指数显著降低。此外，β多样性的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示，ND组的肠道菌群与HFD组的肠道菌群有显著的分离趋势，而JSTE干预组与HFD组的肠道菌群有显著的分离趋势，并且接近ND组（图4B）。这些结果表明，JSTE可以有效改善大鼠高脂肪饮食的肠道微生物多样性。

　　图4  补充JSTE调节HFD诱导大鼠的肠道菌群多样性和组成

　　为了进一步探讨JSTE对高脂饮食大鼠肠道微生物结构的影响，分析了肠道微生物在门水平上的变化（图4C）。分类结果表明，厚壁菌门、拟杆菌门、疣菌门和放线菌门是优势菌门。与ND组相比，HFD组厚壁菌门的相对丰度增加，而拟杆菌门的相对丰度显著降低（图4D）。高剂量JSTE干预显著降低厚壁菌门的相对丰度，增加拟杆菌门的相对丰度。同时，JSTE补充剂显著降低了F/B。此外，不同剂量的JSTE不同程度地增加了HFD喂养大鼠放线菌的相对丰度。

　　在高脂饮食的干预下，Ruminococcaceae、Clostridiaceae、Verrucomicrobiaceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae和Lactobacillaceae的相对丰度呈不同程度的下降趋势，而Peptostreptococcaceae、Erysipelotrichaceae和Helicobacteraceae的相对丰度则有所增加。然而，JSTE可显著降低瘤Ruminococcaceae、Erysipelotrichaceae和Desulfovibrioceae的相对丰度，显著增加高脂饮食大鼠Peptostreptococcaceae和Bifidobacteriaceae的相对丰度。属水平分类结果显示，主要细菌为Akkermansia、Blautia、Clostridium、Bacteroides、Dorea和Ruminococcus。高脂肪饮食改变了大鼠的肠道微生物组成，JSTE部分恢复了被HFD破坏的肠道微生物的健康组成（图4E）。

　　为了进一步确定哪些细菌可能导致肥胖，对相对丰度最高的250个ASV进行了LDA，以获得每组中的主要ASV（图5A）。热图显示5组68种优势ASV，表明JSTE可以不同程度地改变高脂饮食大鼠细菌的相对丰度。JSTE干预后，高脂饮食大鼠15个ASVs几乎逆转至ND组相同水平，其中7个ASV属于Lachnospiraceae（ASV0013、ASV0030、ASV0050、ASV0099、ASV0132、ASV148和ASV176），3个ASV属于Ruminococcaceae（ASV0049、ASV0092和ASV0151），2个ASV属于Erysipelotrichaceae（ASV0147和ASV0226）。为了探究肠道微生物与身体肥胖指标之间的关系，对前50个属和肥胖指标进行了Spearman相关性分析（图5B）。结果显示，19个细菌属与肥胖指标呈显著正相关或负相关。

　　图5  （A）根据LEfSe分析，JSTE干预改变了肠道菌群组成；（B）属水平理化指标与肠道菌群群落之间的Spearman相关性

　　为了进一步了解不同治疗组之间具有显著差异的功能，本研究基于京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库，通过PICRUSt软件对肠道微生物功能进行了注释。采用STAMP软件分析JSTE处理组和HFD组在P＜0.05水平下的预测结果。与HFD组的比较显示，HFD-L、HFD-M和HFD-H干预后，21条（12条增加，9条减少）、2条（1条增加，1条减少）和30条（17条增加，13条减少）代谢途径发生明显改变，主要包括LPS生物合成、糖胺聚糖降解、鞘脂代谢和次级胆汁酸生物合成代谢。因此，补充JSTE可以改变高脂肪饮食大鼠的肠道菌群功能（图6）。

　　图6  JSTE对PICRUSt预测的微生物群落功能的影响

　　Conclusion

　　研究表明，JSTE可以显著降低HFD诱导的大鼠体质量增加、血脂水平和脂肪堆积，改善肝组织脂肪损伤，增加肠道紧密连接蛋白的表达，缓解肠道炎症和代谢性内毒素血症，抑制慢性低度炎症。此外，JSTE可以有效调节肠道微生物的多样性和结构组成。某些类型的细菌，包括Bifidobacteriaceae、Bacteroidaceae、Akkermansia和Clostridium，这些细菌与肥胖呈负相关，在JSTE干预下有效增加。此外，Desulfovibrioceae和Erysipelotrichaceae与肥胖呈正相关，JSTE显著降低。

Junshanyinzhen tea extract prevents obesity by regulating gut microbiota and metabolic endotoxemia in high-fat diet fed rats

　　Jian Ouyang

　　a,b,c

　　, Xiuping Li

　　a,b,c

　　, Changwei Liu

　　a,b,c

　　, Danmin Lu

　　a,b,c

　　, Jie Ouyang

　　a,b,c

　　, Fang Zhou

　　a,b,c

　　, Qi Liu

　　a,b,c

　　, Jianan Huang

　　a,b,c,d,*

　　, Zhonghua Liu

　　a,b,c,d,*

a

Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

b

National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

c

Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

d

Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

　　*Corresponding author.

Abstract

　　Obesity is associated with gut dysbiosis and metabolic endotoxin. Junshanyinzhen tea extract (JSTE) reduced fat accumulation and body weight in obese mice. However, the effects and mechanism of JSTE in preventing obesity were unclear. Therefore, we used different doses of JSTE (75, 150 and 300 mg/(kg·day)) to evaluate the effect on high-fat diet (HFD) -induced rats under 8 weeks of intervention. Here, our results showed that JSTE could significantly reduce body weight gain, blood lipid levels and fat accumulation, improve fatty damage in liver tissue (PP P P Akkermansia, andClostridium, which are negatively related to obesity, were increased. Together, these results suggested that JSTE might effectively prevent obesity by modulating gut microbiota dysbiosis, intestinal barrier dysfunction, metabolic endotoxemia and chronic low-grade inflammation in HFD-induced rats.

　　Reference:

　　OUYANG J, LI X P, LIU C W, et al. Junshanyinzhen tea extract prevents obesity by regulating gut microbiota and metabolic endotoxemia in high-fat diet fed rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2036-2047. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250169.

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