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CAR不止于肿瘤治疗，CAR在感染性疾病和自身免疫疾病的新发展

来源：泰然健康网时间：2024年11月22日 08:50

▉ 导读

近年来，CAR技术高速发展，在血液肿瘤治疗方面取得了突破性成功，多款CAR-T药物获批上市。CAR技术远不止于肿瘤治疗，在感染性疾病治疗及自身免疫疾病中也有着新的发展。

图源：《 regulatory T cells (Treg ) and their roles in immu ne system with respect to imm unopath olo gical dis o rders》

T细胞在控制癌症、传染病和自身免疫疾病发挥着关键作用，其中主要两大类T细胞协同工作，维持免疫稳态。第一个亚群是效应T细胞，能够消除病原体和肿瘤，虽然效应T细胞反应通常是有效的，但一部分传染病和肿瘤已经进化出各种各样的逃逸机制来绕过T细胞控制；第二个亚群是调节性T细胞(Treg)，调节自身免疫反应，在自身免疫疾病中也存在一定局限。

图源：https://www.creative-biolabs.com/blog/index.php/is-bio-distribution-study-necessary-for-car-t-therapy/

嵌合抗原受体 (CAR) 技术已成为重编程T细胞一种有前途的技术，以克服天然T 细胞的不足。CAR这一概念最早出现于1990年代，科学家发现T细胞经嵌合抗原受体及CD3胞内激活信号域修饰后，可使T细胞可直接特异性识别细胞表面抗原发挥作用。CAR技术直接改变了T细胞识别抗原的方式，绕过了MHC限制性，具有高特异性，避免了T细胞免疫逃逸。

此文献探讨利用CAR技术治疗HIV以及自身免疫和移植排斥疾病机遇与挑战。

▉CAR-T细胞清除HIV

HIV感染人体后引发抗病毒免疫，但免疫系统无法完全清除被感染的细胞，且被感染细胞会下调抗原表达来逃避免疫监视，一部分潜伏细胞休眠数年，机会性产生病毒，需终生进行抗病毒治疗。早期抗病毒治疗虽能减少病毒载量但不能完全清除HIV病毒。一些因素如病毒逃逸、T细胞功能紊乱、免疫细胞耗竭影响HIV病毒的清除。

CAR-T治疗HIV（图源：https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00361）

目前抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy, ART)可有效控制HIV感染，但无法完全清除体内HIV病毒。

CTL细胞 (细胞毒性T细胞)是机体应对病毒感染的主力军，但CTL细胞抗原识别具MHC限制性，CAR修饰CTL细胞能够避免CTL细胞局限性（详见下表），可有效控制感染，并防止潜伏病毒再激活。

靶向HIV的CART细胞历经几代发展逐步成形。

1995-2005年一代CAR结构的靶向CD4-CART细胞证明了细胞治疗HIV的安全性和可行性，但一代CAR结构中仅包含一个共刺激因子结构域，作用有限，未能持久地减少血液和组织内的病毒负荷。

随着二代CAR结构的更新，胞内信号域含2个共刺激因子结构域4-1BB+CD3或CD28+CD3，提升T细胞的功能。较一代，基于4-1BB+CD3二代 CD4-CAR-T细胞(下图 a)体外抗病毒效果提升了50倍，小鼠感染模型中能够显著降低病毒负荷。靶向HIV的二代CAR结构的CAR-T细胞，其抗原识别区域为靶向Env蛋白保守位点的scFv，包括CD4结合位点、gp41、多聚糖，为广谱中和抗体（下图 b）。尽管scFv-CART在体外可发挥较强的抗病毒作用应用于临床也存在一些挑战，需克服HIV逃逸及持久性差的困难。

CD4-CART细胞治疗HIV示意图

此外，Bi-CAR双特异性CAR设计是将CD4与bNab中的scFv或人C型凝集素识别域（CRD）融合，CD4片段与Env蛋白的gp120亚基结合，CRD结合Env蛋白中的糖基部分，但CRD与可正常细胞结合引起副作用。（上图 c和上图 d）

图源：《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

维持CAR-T细胞体内持久性的策略

1. 多次输注 持久性与CAR-T功能的发挥有着重要的关联，CD19-CAR-T抗肿瘤的研究中，B细胞肿瘤抗原负荷能够影响CAR T细胞的增殖和持久性，而在HIV感染中，接受cART抗逆转录病毒治疗的个体抗原负荷影响有限。维持CAR-T细胞的持久性需多次输注 HIV 特异性 CAR T 细胞，维持足够数量以应对反弹。 2. 加强免疫治疗 抗病毒疫苗加强免疫以维持足够多的抗原特异性的记忆细胞。此策略也可应用于CAR-T抗病毒研究中，表达病毒抗原的CART细胞通过TCR信号途径刺激HIV特异性CAR-T细胞，治愈HIV还需要CART细胞能够在低抗原负荷中持久生存。 3. HSPC来源CART细胞 造血干细胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC)具有自我更新能力，可实现持久性。造血干细胞来源的T细胞可能会克服外周血来源的细胞在较低抗原负荷环境中的持续性差的问题。HPSC来源的一代CART细胞可以稳定生存近2年,且能避免产生CAR与TCR交叉反应的问题。

图源：《Gene therapy targeting haematopoietic stem cells for inherited diseases: progress and challenges》

CAR-T治疗HIV也存在诸多挑战：

1.抗性

CAR-T细胞也会受到HIV病毒感染，保护CAR-T细胞免受HIV感染是至关重要的。CCR5是病毒进入机体的重要分子，科学家将靶向CCR5的shRNA基因整合到CAR-T 细胞中，shRNA下调CCR5表达防止病毒感染CART细胞。此外，研究者采用锌指核酸酶编辑、定点 megaTAL 核酸酶等基因编辑技术修饰CCR5阻止HIV病毒进入机体。

研究者认为携带完整HIV病毒的CD4+T细胞是CART治疗后复发的原因，此细胞下调Nef表达逃避CTL杀伤。CTL细胞识别病毒需要MHC分子，而CAR-T细胞非MHC限制性，可识别完整的HIV病毒，裂解含HIV前病毒的CD4+T细胞。采用延迟逆转剂LRA破坏病毒潜伏状态，潜伏病毒可以被激活并被免疫细胞杀死，但逆转剂并不能减小潜伏病毒数量。

HIV在B淋巴滤泡中发生免疫逃逸，表现为HIV特异性CTL细胞在淋巴组织中毒性降低，低表达穿孔素和颗粒酶，不能清除被感染的CD4+Tfh细胞。CART通过表达CCR5进入B淋巴滤泡中，清除病毒感染细胞，采用基因编辑修饰CART细胞可将CART细胞带入被感染组织位点。

CART在B淋巴滤泡中的作用

2. 毒性

由于HIV的Env蛋白非自身抗原，可实现HIV特异性靶向，毒性较小但临床上的毒性未见有报道。

3. 细胞因子风暴

肿瘤研究中，高抗原负荷产生的细胞因子风暴比较严重。而对于HIV治疗中，初期抗原负荷低，出现细胞因子风暴可能性小；但当CART细胞不能控制HIV时，可能会出现细胞因子风暴，通常采用IL-6或者cART终止不良反应。

4. 高成本是肿瘤和HIV治疗中的共同重要问题。

总结

二代CAR-T细胞在应用于小鼠和非灵长类HIV感染模型中是安全有效的。但是，成功的CAR-T细胞治疗需长期持久并能够清除潜在的HIV病毒。目前来看增强CAR-T在较低抗原负荷中持久性及增强CAR-T耐受HIV感染还任重而道远。 ▉ CAR-T用于自身免疫疾病T细胞维持机体稳态（图源：https://doi.org/ 10.1016/j.molmet.2013.12.005）

自身免疫疾病治疗常会产生副作用。CAR-T作为一种突破性疗法，可直接杀死自身病理性的免疫细胞。Treg细胞在调节自身免疫性疾病起着重要作用。CAR分子可以引导Treg细胞到达免疫环境中，发挥特异性的免疫抑制功能。

图源: 《Prospects of the Use of Cell Therapy to Induce Immune Tolerance》

CAR Treg 细胞自身免疫疾病中的试验

CAARS（Chimeric autoantibody receptors）嵌合自身抗体可使CAART细胞靶向破坏自身免疫B细胞，当自身免疫B细胞上的BCR受体遇到CAART细胞时，可被破坏无法产生抗体。

在寻常疱疹小鼠模型中，由于自身免疫B细胞靶向自身的desmogleins蛋白，导致皮肤粘膜发生疱疹，传统上用皮质类固醇和其他免疫抑制剂进行治疗减少全身性免疫反应。CART突破性疗法通过表达desmoglein3二代CAAR（4–1BB–CD3ζ胞内信号域）T细胞，与BCR相互作用，诱导自身免疫的B细胞裂解发挥作用，以此思路类推，CAART细胞可应用于其他B细胞相关的自身免疫疾病中，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎。

另一项标志性研究，在小鼠模型中靶向TNBS的CAR Treg细胞可用于治疗TNBS引起的结肠炎，体内可检测到CAR T reg细胞，能够以抗原特异性增殖，可运输到靶器官并在靶器官中增殖，结果显示CAR T reg细胞可预防或改善小鼠结肠炎。图源：《Application of CAR-T Cell Therapy beyond Oncology:Autoimmune Diseases and Viral Infections》

CAR Treg 细胞在器官移植中应用：

识别 HLA 分子（human leukocyte antigen, 人类白细胞抗原）的嵌合抗原受体 (CAR) 的调节性 T (Treg) 细胞为自身免疫提供了理想的方案（见下图）。HLA因其表达量高且仅在移植器官上表达，是理想治疗靶点。此外，靶向HLA的CAR Treg 细胞不会对移植细胞的功能产生影响。

HLA-A2 特异性 CAR Treg 细胞已被用于预防免疫缺陷小鼠的移植物抗宿主病 (GVHD)和皮肤移植排斥反应，体外FOXP3表达水平正常，具有良好扩增能力，细胞毒性小。重要的是，猿猴和人类 MHC 分子高度保守，可在灵长类动物上直接HLA特异性CAR评估器官移植可能性，易于动物模型的评价。

CAR-Treg治疗GVHD

CAR-T治疗自身免疫疾病中也存在诸多挑战：

1. 靶标选择

与肿瘤靶标选择类似，自身免疫靶标也需要在细胞表面高表达且具有组织特异性。肿瘤治疗中靶外毒性的副作用是非常严重的，而自身免疫疾病治疗中，CAR Treg 细胞组织外产生副作用小。然而，在某些CAR可观察到较强的信号会使CAR Treg 细胞产生组成型抑制活性；

另一问题，CAR Treg细胞可能会优先归巢到组织外，可能会限制特异性CAR Treg细胞疗法。此外，Treg 细胞在其他健康组织中的积累可能会有利于肿瘤形成或病原体存活，这一问题目前尚未得到解决。

2. 细胞稳定性

理论上，若效应CAR-T细胞转化为 Treg 细胞可能会加速疾病进展，但目前在癌症试验中尚未观察到。相比之下，若CAR Treg细胞转化为效应T 细胞有可能加剧疾病进展，可能会引起重大的安全问题。小鼠模型研究表明，当Treg 细胞暴露于炎症环境，细胞会下调FOXP3 的表达并产生促炎作用。因此，β细胞特异性CAR Treg 细胞转化为效应T细胞可能会造成对β细胞的杀伤，并加速I型糖尿病进展。

另在Treg 细胞分离时会出现效应CAR T 细胞的污染。Treg细胞是一种罕见的细胞群，几乎不可能达到100%的纯度，分离时会带来细胞稳定性问题。为提高CAR Treg细胞稳定性，选择适宜共刺激因子结构域是十分重要的，研究表明CD28信号对于Treg细胞维持、增殖和功能至关重要。

图源：《Chimeric Antigen Receptor (CAR)Treg: A Promising Approach toInducing Immunological Tolerance》

3. 安全性

起始材料影响Treg细胞的纯度，存在效应T细胞污染可能会引起安全性问题。起始材料的应选择脐带血而非成人外周血，因为脐带血更容易分离Treg细胞，并维持Treg 细胞早期表型。

在患者无自体脐带血时，第三方脐带血是一种可行的、安全的替代方案，已在临床试验中使用。在没有合适的脐带血细胞来源的情况下，成人PBMC也可分离幼稚的Treg 细胞。另外，自杀开关的设计能够使CAR T 细胞发生可控的凋亡，如当 FOXP3 表达丢失或当 IL-17促炎细胞因子表达时，诱导细胞死亡，可以减轻副作用。

4. 剂量和持久性

剂量关系到细胞药物的安全性和有效性。CAR T细胞是一种“活的”药物，半衰期难以确定。对最佳剂量的确定十分复杂且依赖于疾病，如用于GVHD治疗中，若患者体内存在大量抗原可需要相对较小剂量的 CAR Treg 细胞。Treg 细胞本身是一种占比较小的细胞群，可能需要高效的培养系统才能达到 CAR Treg 细胞的目标剂量。目前CAR-T 细胞持久性的研究大部分来自于外周血而非组织。当靶抗原有限时，效应CAR-T 细胞可能无法做出反应。相比之下，CAR Treg 细胞能够产生响应，保护正常细胞不被清除，持久性可能优于效应CAR-T 细胞。

图源：《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

总结

在动物模型中，CAR 技术用于治疗自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥反应显示出前景。然而，在研究剂量之前需确定CAR的最佳胞外结合域和胞内信号域，以提高安全性、有效性和持久性。由于Treg细胞和效应T细胞之间差异以及疾病特异性要求，在开发 CAR Treg 细胞的主要治疗产品方面仍有许多工作要做。

图源 : 《Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision》

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