一种低聚半乳糖的液相色谱

本发明涉及分析检测，尤其是涉及一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法及其应用。

背景技术：

1、低聚半乳糖（galactooligosaccharides, gos）是一种具有天然属性的功能性低聚糖，主要存在于动物乳汁和母乳中，已被允许作为营养强化剂添加到婴幼儿配方奶粉等食品中，同时在医药和饲料等行业也受到广泛关注。gos的分子结构是在半乳糖或葡萄糖一端通过不同糖苷键（有α/β构型和不同的连接位置（(1→6)，(1→4)，(1→3)或(1→2)））连接1~7个半乳糖基，即(gal)n-gal/glc（n=1～7）（gal, galactose, 半乳糖；glc, glucose,葡萄糖）。gos目前主要采用半乳糖苷酶催化乳糖制备，受酶来源和反应条件的影响，不同企业生产的gos在化学组成上存在较大差异。构效关系研究显示gos的功能与其结构密切相关，含不同糖苷键的异构体或由不同单糖组成的异构体往往具有不同的生物活性。近年来，随着理论上定向改造半乳糖苷酶以用于定向合成具有特定功能活性的特定gos组分成为可能，对特定构型gos组分的分析也提出了要求。因此，开发gos中不同异构体组分的定性分析方法，对建立完整的gos异构体营养价值判定体系，引导工业生产出高活性、高稳定性和高附加值的gos产品具有重要意义，有助于增强我国乳制品与微生态营养健康科技的应用发展及国发健康。

2、由于聚合度、单糖组成和糖苷键的不同，gos的组成复杂且存在多种异构体，这对gos各组分的定性分析提出了挑战。液相色谱技术是目前gos分析检测的主要方法，具体包括：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，hplc）和离子色谱法中的高效阴离子交换色谱法（high performance anion exchange chromatography，hpaec）。然而这些方法存在分析周期较长、样品前处理步骤复杂、多种异构体的分离鉴定难度大等问题。核磁共振谱（nuclear magnetic resonance，nmr）可以区分异构体，但该法需要预先获得高纯度组分，而纯化获得高纯度组分需要较长周期且步骤繁琐。质谱（massspectrometry，ms）是众多分析技术中同时具备灵敏度高、特异性好、响应速度快的分析技术，尤其是高分辨质谱，其针对基质复杂的样品在灵敏度和抗干扰能力方面表现出绝对优势，正成为糖类检测方法的重要发展趋势。然而，仅仅通过高分辨质谱的m/z值无法区分具有相同m/z值的异构体。

3、因此，有必要开发一种能够快速鉴定gos糖苷键的α/β构型和糖苷键的连接位置的方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一方面提出一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，能够有效快速鉴定低聚半乳糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置。

2、本发明第二方面还提供一种应用。

3、根据本发明的第一方面实施例提供的一种低聚半乳糖的液相色谱-质谱联用检测方法，包括如下步骤：

4、s1、标准品溶液配制：将不同的糖标准品配制成糖标准品储备液；

5、s2、将实际样品进行前处理得到待测液；

6、s3、液相色谱质谱检测：将s1的糖标准品储备液和s2的待测液通过液相色谱质谱进行分离测定；

7、s4、色谱质谱图分析：记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；计算特征子离子/母离子强度的比值；通过保留时间和色谱峰在串联质谱图上的子离子与母离子强度比值来鉴定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置。

8、根据本发明实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：

9、本发明基于液相色谱质谱分析提出了一种利用低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖各异构体在亲水柱上的保留时间，以及低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖在亲水柱上分离的各异构体在串联质谱图上的子离子与母离子强度比值，来鉴定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷键的α/β构型和/或糖苷键的连接位置的方法。本发明操作简便、可直观快速鉴定低聚半乳糖的结构，可广泛应用于各种低聚半乳糖产品及含低聚半乳糖食品中低聚半乳糖的结构分析，为低聚半乳糖的构效关系研究提供了可靠的方法，有利于高活性低聚半乳糖产品的开发和质量控制。

10、根据本发明的一些实施例，所述标准品储备液的浓度为0.001~0.1 mg/ml。

11、根据本发明的一些实施例，所述标准品包括曲二糖(α-glc-[1→2]-glc)、异麦芽糖(α-glc-[1→6]-glc)、黑曲霉二糖(α-glc-[1→3]-glc)、蜜二糖(α-gal-[1→6]-glc)、麦芽糖(α-glc-[1→4]-glc)、1,4-半乳二糖(β-gal-[1→4]-gal)、1,6-半乳二糖(β-gal-[1→6]-gal)、乳糖(β-gal-[1→4]-glc)、纤维二糖(β-glc-[1→4]-glc)、槐糖(β-glc-[1→2]-glc)、昆布二糖(β-glc-[1→3]-glc)、龙胆二糖(β-glc-[1→6]-glc)、麦芽三糖(α-glc-[1→4]-α-glc-[1→4]-glc)、纤维三糖(β-glc-[1→4]-β-glc-[1→4]-glc)、异麦芽三糖(α-glc-[1→6]-α-glc-[1→6]-glc)、黑曲霉三糖(α-glc-[1→3]-α-glc-[1→3]-glc)、昆布三糖(β-glc-[1→3]-β-glc-[1→3]-glc)、麦芽四糖(α-glc-[1→4]-α-glc-[1→4]-α-glc-[1→4]-glc)、纤维四糖(β-glc-[1→4]-β-glc-[1→4]-β-glc-[1→4]-glc)、异麦芽四糖(α-glc-[1→6]-α-glc-[1→6]-α-glc-[1→6]-glc)、黑曲霉四糖(α-glc-[1→3]-α-glc-[1→3]-α-glc-[1→3]-glc)、昆布四糖(β-glc-[1→3]-β-glc-[1→3]-β-glc-[1→3]-glc)中的至少一种。

12、根据本发明的一些实施例，所述液相色谱的条件为：

13、色谱柱：infinity lab poroshell 120 hilic（3.0 mm×100 mm, 2.7 μm）；柱温：30~40 ℃；进样量：0.5~2 μl；流速：0.4~0.7 ml/min；

14、流动相：水（a）-乙腈（b）；梯度洗脱：0~10 min，90%~75% b；10~10.5 min，75%~90%b；10.5~15.5 min，90% b。

15、根据本发明的一些实施例，所述质谱条件为：电喷雾离子源：正离子，质谱扫描范围：m/z 50~1000 ；全扫描模式和母离子（m/z）：[c12h22o11+na]+（m/z 365.1054）、[c18h32o16+na]+（m/z 527.1583）、[c24h42o21+na]+（m/z 689.2111）的串联质谱扫描。

16、根据本发明的一些实施例，步骤s4中，所述色谱质谱图分析包括，记录标准品和待测液中各色谱峰的保留时间，以及标准品和待测液中各色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；计算特征子离子/母离子强度的比值；以保留时间为横坐标，特征子离子/母离子强度的比值为纵坐标对标准品和待测液作图；以不同结构的标准品和/或不同样品为横坐标，特征子离子/母离子强度的比值为纵坐标作图。

17、根据本发明的一些实施例，步骤s4中，所述色谱质谱图分析包括，通过对全扫描模式色谱图提取离子m/z 365.1054、m/z 527.1583和m/z 689.2111以获取提取离子色谱图，根据m/z 365.1054的提取离子色谱图记录标准品和待测液中二糖各异构体色谱峰的保留时间，根据m/z 527.1583的提取离子色谱图记录标准品和待测液中三糖各异构体色谱峰的保留时间，根据m/z 689.2111的提取离子色谱图记录标准品和待测液中四糖各异构体色谱峰的保留时间；基于母离子[c12h22o11+na]+（m/z 365.1054）的串联质谱扫描获取二糖各异构体色谱峰的串联质谱图，基于母离子[c18h32o16+na]+（m/z 527.1583）的串联质谱扫描获取三糖各异构体色谱峰的串联质谱图，基于母离子[c24h42o21+na]+（m/z 689.2111）的串联质谱扫描获取四糖各异构体色谱峰的串联质谱图，根据二糖、三糖和四糖各异构体色谱峰的串联质谱图记录标准品和待测液中二糖、三糖和四糖各异构体色谱峰在串联质谱图上的特征子离子和母离子强度；所述特征子离子为[m+na-18]+、[m+na-60]+、[m+na-120]+、[m+na-162]+（对于二糖，m代表c12h22o11，对于三糖，m代表c18h32o16，对于四糖，m代表c24h42o21）；计算子离子/母离子强度的比值：[m+na-162]+/[m+na]+、[m+na-18]+/[m+na]+、[m+na-60]+/[m+na]+、[m+na-120]+/[m+na]+；以保留时间为横坐标，[m+na-162]+/[m+na]+为纵坐标对标准品和待测液作图，以及以不同结构的标准品和/或不同样品为横坐标，[m+na-18]+/[m+na]+、[m+na-60]+/[m+na]+、[m+na-120]+/[m+na]+为纵坐标作图。

18、根据本发明的一些实施例，所述前处理包括将低聚半乳糖样品溶于水，过滤即得待测液；或对含有低聚半乳糖的物质与水混匀超声，加入沉淀剂、混匀静置、离心、取上清液加水稀释，过滤得待测液。

19、根据本发明的一些实施例，所述沉淀剂为乙腈。

20、根据本发明的一些实施例，所述含有低聚半乳糖的物质包括含低聚半乳糖的奶粉、米粉、酸奶、乳酸菌饮料中的至少一种。

21、根据本发明的一些实施例，低聚半乳糖样品的浓度在0.004~0.4 mg/ml。

22、根据本发明的一些实施例，所述超声的时间为10~30 min。

23、根据本发明的一些实施例，所述离心的转速为4000~6000 r/min。

24、根据本发明的一些实施例，所述稀释的倍数为10~50倍。

25、根据本发明的第二方面实施例提供的上述所述的液相色谱-质谱联用检测方法在鉴别低聚半乳糖的结构中的应用。

26、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

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